ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

Механизмы противоопухолевой
активности гепарина на основе экспериментальных моделей рака

Сокращенное изложение

T. M. H. Niers, C. P. W. Klerk, M. DiNisio, C. J. F. Van Noorden et al.
Crit. Rev. Oncol./Hematol. 2007;61(3):195–207

1. Введение

Несмотря на то что взаимосвязь тромбоза и рака общепризнана, влияние состояния свертывания крови на прогноз в отношении злокачественного процесса до конца не изучено. На протяжении многих лет выдвигались гипотезы о ключевой роли активированных факторов свертываемости крови в биологии рака, подтвержденные клиническими исследованиями гепаринов и доклиническими исследованиями на опухолевых моделях in vivo и in vitro.

Положительное влияние НМГ на выживаемость подтвердилось в системном обзоре 9 исследований лечения венозной тромбоэмболии (Hettiarachchi R. J. et al., 1999), которым установлено снижение 3-месячной смертности на 49% при лечении НМГ в противовес НФГ.

Снижение смертности отмечалось при различных видах рака, данный феномен не был обусловлен разностью частоты фатальной ВТЭ или кровотечения и на него не влияли другие прогностические переменные.

Для оценки влияния НМГ и НФГ на выживаемость онкологических больных проводились проспективные рандомизированные исследования. Von Tempelhoff  G. F. и Heilmann L. (2000) изучали показатели выживаемости пациентов, которым в послеоперационном периоде вводился НМГ или НФГ в профилактических дозах на протяжении 7 дней. Среди 324 больных, прооперированных по поводу рака молочной железы или органов таза, смертность в группе НМГ составляла 5,7% в противовес 15,6% в группе НФГ (p = 0,005).

Lee А. В. et al. (2003) было рандомизировано 676 онкологических больных с ВТЭ на лечение дальтепарином (Фрагмином) или антагонистами витамина К. Разности в показателях 1-летней выживаемости между группами не прослеживалось. Однако с помощью апостериорного анализа доказано, что у больных без метастазов 1-летняя смертность была значительно ниже в группе дальтепарина (20%), чем в группе антагонистов витамина К (35%) (p = 0,03). Данная разность не была связана с отличиями в частоте фатального тромбоза.

В недавних исследованиях (FAMOUS и MALT) изучалось влияние НМГ на выживаемость онкологических пациентов без ВТЭ. Во время исследования FAMOUS (Kakkar А. K. et al., 2004) 385 больных с раком были рандомизированы на лечение дальтепарином (Фрагмином) в низких дозах (5000 МЕ/день) или плацебо на протяжении 1 года. Достоверной разности в показателях выживаемости между группами обнаружено не было. Тем не менее, в подгруппе больных с относительно благоприятным прогнозом на момент включения в исследование лечение дальтепарином сопровождалось повышенными показателями средней выживаемости (24 месяца в противовес 43 месяцам; p = 0,03). С целью изучения влияния НФГ (Lebeau B. et al., 1994) и НМГ (Altinbas M. et al., 2004) на мелкоклеточный рак легких было проведено два исследования, во время которых обнаружены статистически достоверные преимущества в показателях выживаемости больных, рандомизированных в группу химиотерапии в сочетании с НФГ или НМГ, по сравнению с группой исключительно химиотерапии.

Несмотря на то что в результатах клинических исследований однозначно доказана противораковая активность гепаринов, особенно НМГ, многие вопросы остаются без ответа. Неизвестны механизмы, посредством которых НМГ проявляют противоопухолевую активность даже после непродолжительного лечения. Не установлено, обусловлена ли противоопухолевая активность НМГ исключительно их антикоагуляционным эффектом или же данные препараты влияют еще и на другие биологические процессы. В нашем исследовании изучались доказательства влияния гепаринов на рак по результатам экспериментальных исследований на животных моделях.

2. Гепарины

2.1. Гепарины и низкомолекулярные гепарины

Гепарин относится к семейству гликозаминогликанов. Его длинные молекулы состоят из неразветвленных дисахаридных повторяющихся комплексов, располагаясь в основном на мембране клеток и во внеклеточном матриксе. Гепарин содержится в большом количестве в гранулах тучных клеток. Выделение гепарина из этих гранул в кровоток в ответ на повреждение приводит к угнетению тромбообразования.

НФГ, применяющийся в клинической практике, представлен природными гликозаминогликанами свиного или коровьего происхождения с молекулярной массой в пределах 12 000–14 000 дальтон. НМГ получают из НФГ путем химической или ферментной деполимеризации, фрагменты достигают приблизительно трети размера молекулы гепарина (молекулярная масса составляет около 5000 дальтон).

Антитромботические эффекты гепарина реализуются благодаря взаимодействию с антитромбином. Комплекс гепарин-антитромбин связывается с активированным X-фактором свертываемости, таким образом инактивируя его. Активность против фактора Ха у НФГ и НМГ одинакова.

Разность между НФГ и НМГ заключается в относительной подавляющей активности против фактора Ха и IIa. Фактор IIa инактивируется трехкомпонентным комплексом, состоящим из гепарина, антитромбина и фактора IIa. Для образования данного комплекса в молекуле гепарина должна быть 18-сахаридная последовательность. Большинство цепей НМГ слишком короткое, чтобы образовать такой комплекс. Поэтому НМГ по сравнению с НФГ характеризуются относительно низкой активностью против фактора IIa.

Помимо антитромбина, НФГ и НМГ могут связываться с различными белками и в дополнение к антикоагулянтному эффекту проявлять широкий спектр биологической активности другого характера.

3. Влияние гепаринов на рост экспериментальных первичных опухолей и их метастазирование

В данном обзоре мы отдельно рассматриваем влияние гепаринов на первичные опухоли или метастазы и на способность к метастазированию клеток, введенных с помощью инфузии.

3.1. Влияние гепаринов на рост первичных опухолей или метастазов

Для изучения влияния гепаринов на регресс опухолей у животных, полученных путем подкожной имплантации или химического воздействия, проведено 17 исследований. Только в 4 из них благодаря терапии гепаринами удалось достичь достоверного уменьшения объема первичной опухоли. Эффект гепарина не зависел от метода индукции опухоли на различных животных моделях, а также от промежутка времени между началом лечения гепарином и индукцией опухоли. На эффект гепаринотерапии влияли такие факторы, как доза, вид гепарина и продолжительность лечения. Высокие дозы гепарина (100 ЕД трижды в день на протяжении 15 дней) оказались эффективными (Back N. et al., 1976; Ohkoshi M. et al., 1993), однако результаты не всегда являлись однозначными (Owen Jr. C. А., 1982). Гепарины в низких дозах или при терапии сроком до 15 дней, а также введение очень высоких доз гепарина (200 ЕД) всего лишь три раза в неделю (Chan S. В. et al., 1980) не влияли на рост опухоли. По-видимому, для влияния на рост первичной опухоли гепарины следует вводить длительное время в высоких дозах.

Следовательно, полученные данные указывают на то, что, на основываясь на различных опухолевых моделях, рост первичных опухолей может подавлять только гепарин в высоких дозах и некоторые химически модифицированные гепарины. Важность назначения гепарина в высоких дозах подтвердилась в исследованиях на моделях с внутрибрюшинными опухолями. В 6 из 7 исследований (Goldstein D. S. et al., 1993; Jacobi C. А. et al., 1997, 1999; Neuhaus S. J. et al., 1999; Pross M. et al., 2003, 2004) установлено снижение частоты имплантации опухоли в брюшной полости при введении непосредственно в нее гепарина. Это может послужить доказательством необходимости создания высокой концентрации гепарина вокруг опухолевых клеток. Поскольку модифицированные гепарины с ограниченной или отсутствующей антикоагуляционной активностью также обладают противоопухолевым действием, данный эффект не зависит только от угнетения свертываемости.

3.2. Влияние гепаринов на метастазирование

Большинство случаев смерти от рака обусловлено скорее метастазами, чем первичными опухолями. Поэтому можно предположить, что влияние гепаринов на прогноз при раковом процессе частично или полностью обусловлено предотвращением гематогенного метастазирования.

В период с 1985 по 2005 гг. было проведено 17 исследований, касающихся влияния гепарина на первичные (висцеральные метастазы после внутривенного введения злокачественных клеток) и вторичные метастазы (висцеральные метастазы после подкожной инокуляции раковых клеток). В 14 из указанных исследований гепарин обеспечивал достоверное уменьшение числа метастазов (Drago J. R. et al., 1985; Milas L. et al., 1985; Irimura T. et al., 1986; Beuth J. et al., 1987; Lee А. E. et al., 1988, 1990; Sciumbata T. et al., 1996; Miao H. Q. et al., 1999; Borsig L. et al., 2001; Ono K. et al., 2002; Poggi А. et al., 2002; Amirkhosravi А. et al., 2003; Stevenson  J.  L. et al., 2005; Bereczky B. et al., 2005).

Интервал времени между введением гепарина и внутривенной инокуляцией злокачественных клеток имеет клиническое значение, поскольку внутривенный контакт данных клеток с гепаринами или действие гепаринов могут влиять на способность клеток к выживанию и эндотелиальной адгезии — факторов, необходимых для успешного метастазирования. Антиметастатическая активность гепаринов была обнаружена в 10 исследованиях, во время которых гепарин вводился непосредственно перед внутривенной инокуляцией опухолевых клеток.

4. Механизмы противораковой активности, обусловленной гепарином

Экспериментальные исследования, проанализированные нами, указывают на то, что гепарины подавляют скорее метастазирование, нежели рост опухоли. Гематогенное метастазирование — сложный процесс, во время которого раковые клетки отсоединяются от первичной опухоли, мигрируют через стенку сосудов в кровоток, разносятся по всему организму, присоединяются к эндотелиоцитам и пенетрируют в окружающие ткани. Во время внутрисосудистой фазы раковые клетки чрезвычайно чувствительны к действию защитных механизмов организма и только ограниченное количество злокачественных клеток из попавших в кровоток могут обусловить развитие метастазов, что в итоге приводит к смерти.

Большинство экспериментальных исследований метастазирования заключается во введении опухолевых клеток в хвостовую вену животного, что приводит к образованию метастазов опухоли в легких. Более 90% злокачественных клеток задерживаются в сосудах легких сразу после инъекции (Im J. H. et al., 2004), независимо от состояния гипокоагуляции или дефицита фибриногена, после чего данные клетки сразу обусловливают повышенную свертываемость и внутрисосудистое отложение фибрина. В местной активации системы свертывания крови и образовании сгустка, содержащего фибрин и опухолевые клетки, важную роль играет тканевой фактор (ТФ), на поверхности раковых клеток часто наблюдается его повышенная экспрессия. Быстрое снижение числа тромбоцитов после внутрисосудистого введения опухолевых клеток, вероятно, обусловлено накоплением тромбоцитов в сгустке. Свертывание крови и активация тромбоцитов, обусловленная опухолевыми клетками, могут продлевать жизнедеятельность данных клеток в сосудах легких. В этих тромбоцитарно-фибриновых внутрисосудистых комплексах опухолевые клетки могут расти или погибать либо прикрепляться к эндотелиальной стенке сосудов, впоследствии вызывая инвазию в паренхиму легких. Последнему процессу способствует местный синтез тромбина, активация тромбоцитов под воздействием тромбина и локальное выделение тромбоцитами факторов, способствующих ангиогенезу (фактор роста сосудистого эндотелия, ФРСЭ) и пролиферации (тромбоцитарный фактор 4). Активация тромбоцитов, обусловленная тромбином, приводит к активации интегринового рецептора GP IIb/IIIa на мембране тромбоцитов, а это способствует соединению тромбоцитов с фибриногеном и выделению P-селектина из α-гранул. Повышенный уровень P-селектина на поверхности тромбоцитов и эндотелиоцитов способствует соединению указанных клеток с аберрантными углеводами, находящимися на поверхности мембраны раковых клеток (Kim В. J. et al., 1998). Эти данные указывают на то, что активация тромбоцитов и синтез фибрина — важные механизмы, с помощью которых опухолевые клетки способствуют гематогенному метастазированию. В исследованиях Camerer E. et al. (2004), Karpatkin S. et al. (1988), Cohen S. А. et al. (2000), Amirkhosravi А. et al. (2003) установлено, что низкий уровень тромбоцитов или угнетение их активации приводят к снижению способности опухолевых клеток к метастазированию. Основная проблема применения антитромбоцитарных препаратов при раке заключается в отсутствии селективного действия данных медикаментов. Все имеющиеся антитромбоцитарные средства влияют как на гемостаз, так и на активацию тромбоцитов под воздействием раковых клеток.

Возможное влияние гепаринов на процесс метастазирования заключается в следующем: антикоагулянтное действие; подавление взаимодействия между раковыми клетками, тромбоцитами и эндотелием в период внутрисосудистой диссеминации рака; угнетение гепариназы; конкуренция с фактором роста в присоединении к гепарансульфатпротеогликанам.

4.1. Влияние на свертываемость крови

Активация системы свертывания крови, связанная с наличием опухоли, способствует образованию стромы опухоли и развитию метастазов. Большинство солидных опухолей содержит значительное количество белков фибриногенного происхождения; это свидетельствует, что фибрин играет важную роль в образовании стромы опухолей (Dvorak H. F. et al., 1992; Costantini V. et al., 1993). Хотя гипотеза, что противораковая активность гепаринов обусловлена подавлением синтеза фибрина, выглядит привлекательной, собрано лишь ограниченное количество доказательств, что гепарины оказывают прямое влияние на рост опухоли. Факторы свертывания крови, помимо участия в образовании стромы опухоли за счет фибрина, также могут способствовать метастазированию. Фибрин(оген) способствует образованию метастазов, продлевая выживание ракового эмбола в сосудах (Palumbo J. S. et al., 2000). У мышей с дефицитом фибриногена по сравнению с нормальными особями после внутривенного введения раковых клеток частота легочных метастазов оказалась существенно ниже. Согласно той же экспериментальной модели, специфический ингибитор тромбина гирудин еще больше снижал способность циркулирующих злокачественных клеток к метастазированию, что доказывает повышение риска метастазирования под воздействием тромбина частично благодаря фибриноген-независимому механизму. Гепарины могут взаимодействовать с факторами метастазирования, зависящими от факторов свертывания крови. Обнаружено, что гепарины сокращают время пребывания раковых клеток в легких таким образом снижая способность к образованию метастазов, они также подавляют синтез тромбина и фибрина, благодаря чему угнетают активацию тромбоцитов.

Важный аспект активации системы свертывания крови заключается в экспрессии тканевого фактора (ТФ) на поверхности раковых клеток. Экспрессия ТФ подавляется ингибитором внешнего пути свертывания крови (ИВПСК), который зависит от фактора Ха. ИВПСК в основном синтезируется сосудистыми эндотелиоцитами (Sandset P. M. et al., 1991), данный фактор может подавлять рост метастазов у мышей, что указывает на роль тромбина в процессе метастазирования. Поскольку гепарины также могут стимулировать продукцию ИВПСК, подавляющего прокоагулянтную активность раковых клеток (Mousa S. А. et al., 2004), можно считать, что ИВПСК — одна из мишеней противоопухолевого эффекта гепаринов.

Поскольку некоторыми исследованиями (Irimura T. et al., 1986; Yoshitomi В. et al., 2004; Sciumbata T. et al., 1996, Ono K. et al., 2002; Poggi А. et al., 2002) доказано, что гепарины, не обладающие антикоагулянтным действием, также могут подавлять развитие метастазов, в данном процессе важную роль могут играть другие свойства гепаринов, не связанные со свертываемостью крови.

Например, гепарины с отсутствием антикоагулянтного действия потенциально могут вызывать выделение ИВПСК из сосудистого эндотелия, а ИВПСК оказывает антиметастатический эффект отчасти независимо от системы свертывания крови, воздействуя как ингибитор ангиогенеза (Hembrough T. А. et al., 2003).

4.2. Влияние на селектины

Во время доклинических исследований собрано немало доказательств того, что взаимодействие между раковыми клетками и тромбоцитами способствует внутрисосудистому выживанию и прикреплению злокачественных клеток к поверхности эндотелия (Gasic G. J., 1984; Honn K. V. et al., 1992; Nieswandt B. et al., 1999). Комплексы, состоящие из тромбоцитов и раковых клеток, образуют щит, защищающий их от уничтожения иммунокомпетентными клетками, и способствует адгезии злокачественных клеток к эндотелию сосудов (Borsig L. et al., 2001). Описанному взаимодействию между раковыми клетками, тромбоцитами и эндотелиоцитами способствует контакт гликопротеинов на мембране злокачественных клеток с селектинами на поверхности тромбоцитов и эндотелия.

Селектины — рецепторы адгезии, распознающие атипичные углеводородные молекулы на поверхности злокачественных клеток. Их физиологическая функция заключается в стимуляции адгезии клеток при воспалительном процессе, иммунном ответе и заживлении раны. Селектины несут основную ответственность за первые этапы адгезии клеток, и при их отсутствии все последующие этапы, происходящие благодаря интегринам и другим молекулам адгезии, завершаются значительно позже или не осуществляют совсем. Имеет место экспрессия селектинов на поверхности лейкоцитов (L-селектин), тромбоцитов (P-селектин) и сосудистого эндотелия (E- и P-селектин).

Гепарин и гепариноподобные соединения могут подавлять соединение L-селектина и P-селектина с тетрасахаридами на поверхности раковых клеток (Norgard-Sumnicht K. E. et al., 1993; Koenig А. et al., 1998), что приводит к подавлению воспалительного ответа (Nelson R. M. et al., 1993) и может способствовать метастазированию (Varki N. M. et al., 2002).

4.3. Влияние на гепараназу

Важный этап процесса инвазии рака и метастазирования заключается в расщеплении различных компонентов внеклеточного матрикса, включая коллаген, ламинин, фибронектин и гепарансульфатпротеогликаны, с помощью таких ферментов, как матриксные металлопротеазы, сывороточные протеазы, цистеиновые протеазы и эндогликозидазы (Nakajima M. et al., 1988; Vlodavsky И. et al., 1990). Гепараназа (фермент из класса эндогликозидаз) может разрушать различные компоненты внеклеточного матрикса, способствуя инвазии опухоли.

Экспрессия гапараназы в нормальных тканях незначительна, однако имеет место во многих опухолях, где она активно стимулирует ангиогенез и способность к метастазированию (Vlodavsky И. et al., 2002). Повышенная экспрессия гепараназы человека взаимосвязана с поздними стадиями и метастазированием опухолей молочной железы, толстого кишечника, яичников, мочевого пузыря, поджелудочной железы, острого миелоидного лейкоза, немелкоклеточного рака легких и миеломы. Гепараназа играет важную роль в расщеплении гепаран-сульфатных групп гепарансульфатпротеогликанов с образованием фрагментов молекул, которые в большей степени, нежели неизменные гепаран-сульфатные группы, потенцируют активность факторов роста.

Немало исследований свидетельствует о том, что гепарин и некоторые его химически модифицированные производные подавляют активность гепараназы опухолевых клеток, что связано со снижением способности опухоли к метастазированию (Irimura T., 1986; Vlodavsky И. et al., 1994; Yoshitomi В. et al., 2004; Sciumbata T. et al., 1996, Ono K. et al., 2002; Nakajima M. et al., 1988; Parish C. R. et al., 1987; Vlodavsky И. et al., 1999; Poggi А. et al., 2002; Miao H. Q. et al., 1999).

4.4. Влияние на гепарансульфатпротеогликаны

Растворимые гепарины конкурируют с гепаран-сульфатными группами гепарансульфатпротеогликанов за соединение с факторами роста и другими белками и могут обусловливать выделение этих белков из внеклеточного матрикса. НФГ и НМГ in vitro (Parish C. R. et al., 1987) способны подавлять ангиогенез, вызванный γ-фактором роста фибробластов, разрывая связь между данным фактором и гепаран-сульфатными группами. У человека терапевтические дозы НФГ обусловливают повышение уровня факторов роста, таких как γ-фактор роста фибробластов, в сыворотке крови (D’Amore P. А., 1992; Folkman J. et al., 1989). Soker S. et al. (1994) доказали, что НМГ, в отличие от НФГ, благодаря меньшему размеру молекулы могут препятствовать соединению факторов роста с их рецепторами.

Небольшие фракции гепарина, в отличие от НФГ, in vivo могут подавлять ангиогенез, обусловленный γ-фактором роста фибробластов и фактором роста сосудистого эндотелия (Jayson G. C. et al., 1997).

5. Выводы

Процесс метастазирования опухоли очень сложен, он включает как механизмы, зависящие от системы свертывания крови, так и механизмы, не зависимые от коагуляции. Агрегация и активация тромбоцитов, обусловленная опухолевыми клетками, играет важную роль в защите злокачественных клеток, их успешной адгезии и инвазии через стенку эндотелия. Результаты многих исследований поддерживают гипотезу, что гепарин влияет скорее на каскадный процесс метастазирования, чем на рост первичной опухоли. В большинстве экспериментальных моделей метастазирования опухолевые клетки вводились внутривенно в хвостовую вену, в результате чего развивались метастазы в легких. Во время данного процесса после оседания опухолевых клеток в первой сетке капилляров (легких) наступает активация системы свертывания крови благодаря тканевому фактору на поверхности злокачественных клеток, агрегации и активации тромбоцитов. В данном процессе важную роль играет тромбин, частично независимый от факторов свертывания крови. Гепарины могут воздействовать на различные звенья данного процесса.

Поскольку на животных моделях химически модифицированные гепарины с ограниченной или отсутствующей антикоагулянтной активностью также проявляли антиметастатическое действие, противораковая активность гепаринов также может реализовываться с помощью механизмов, не зависящих от системы свертывания крови (Yoshitomi В. et al., 2004; Sciumbata T. et al., 1996; Poggi А. et al., 2002; Kragh M. et al., 2005). К ним относятся: подавление гепарином межклеточных реакций, стимулирующих селектины; ингибирование гепараназы и ангиогенеза; стимуляция выделения ингибитора внешнего пути свертывания крови.

Как объяснить действие препаратов, преимущественно подавляющих метастазирование, если противораковая активность гепаринов проявляется и у больных с уже имеющимися метастазами? Расширяется доказательная база в пользу того, что продолжение процесса метастазирования способствует прогрессированию рака и еще большей его диссеминации. Доказано, что у большинства онкологических больных можно выявить циркулирующие злокачественные клетки (Cristofanilli M. et al., 2004) и что их количество влияет на прогноз (Cristofanilli M. et al., 2005). На основании приведенных данных можно прийти к выводу, что у больных с метастатическим процессом прерывание метастатического каскада с помощью гепаринов может благоприятно повлиять на результаты лечения. Это также может объяснить феномен, почему гепарины проявляют противораковое действие в основном у пациентов с ограниченным метастатическим заболеванием, а у больных с терминальной стадией данные препараты неэффективны (Klerk C. P. et al., 2005; Kakkar А. K. et al., 2004).

В отличие от цитотоксической химиотерапии, где лечение направлено против самой раковой клетки, гепарины воздействуют в основном на мишени за пределами злокачественных клеток. Процесс метастазирования, очевидно, не является специфическим для различных видов рака и зависит от действия общих внеклеточных механизмов, поэтому благоприятное влияние гепаринов на прогноз при злокачественном процессе не ограничивается какими-либо определенными видами рака.

Проблема противораковой активности гепаринов требует дальнейшего изучения, тем не менее, однозначно доказано, что лечение гепаринами улучшает прогноз у онкологических больных.

Подготовил Богдан Борис

  • * В Украине препарат зарегистрирован компанией Пфайзер под названием ФрагмИн.