ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ТЕРАПИЯ, НАПРАВЛЕННАЯ НА РЕПАРАЦИЮ СЕРДЕЧНЫХ КЛЕТОК:
КЛИНИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ

Сокращенное изложение

B. J. Gersh, R. D. Simari, A. Behfar et al.
Mayo Clin Proc 2009;84(10):876-892

В данном обзоре методов лечения, направленных на репарацию сердечных клеток, предпринята попытка представить клиническую перспективу и описать научные проблемы, лежащие в основе экспериментальных и клинических исследований, представить результаты проведенных рандомизированных контролированных клинических исследований и дизайн предстоящих, а также обсудить этические и философские вопросы, касающиеся данной проблемы.

Репарацию сердечных клеток (сердечную репарацию) можно рассматривать как следствие трех основных процессов: замена (тканевой трансплантат), омоложение или восстановление (активация существующих сердечных стволовых клеток или других стволовых клеток через паракринные или аутокринные механизмы; модуляция апоптоза, воспаления, ангиогенеза или метаболизма) и регенерация (вживление клеток-предшественников или стволовых клеток, которые созревают до дифференцированных миоцитов). Можно использовать также и комбинированный подход, включающий различные процессы, например, сначала применяется модуляция миокардиального повреждения, после которой назначается терапия, направленная на регенерацию миокарда.

Клиническая необходимость

Ощущается острая необходимость в новых методах терапии сердечно-сосудистых заболеваний, включая подходы к защите, восстановлению и регенерации сердечных клеток. Несмотря на совершенствование методов лечения в острой стадии и положительное влияние методов первичной и вторичной профилактики, ишемическая болезнь сердца (ИБС) остается ведущей причиной смерти в США, а снижение показателей смертности, начавшееся в 1960-х годах, несколько замедлилось в 1990-х. За год в США регистрируется в среднем 1 млн. случаев острого инфаркта миокарда (ИМ), за 3 года смертность у таких людей составляет 25%. Приблизительно 5 млн. пациентов в США страдают сердечной недостаточностью, показатели ежегодной смертности у них достигают 20%. Кроме того, трансплантация сердца никогда не удовлетворит потребностей пациентов в данном методе лечения по причине ограниченного числа доноров, а методы ксенотрансплантации все еще находятся на экспериментальном этапе.

Научные проблемы

Если рассматривать методы клеточной терапии концептуально, то они весьма привлекательны. Что касается патологических состояний, характеризующихся гибелью миоцитов, таких как ИМ и сердечная недостаточность, существует постулат о том, что нежизнеспособный миокард подвергается регенерации или репарации путем доставки в зону повреждения стволовых клеток или клеток-предшественников из различных источников, включая сердце. Традиционно кардиомиоцит считался окончательно дифференцированной клеткой, поэтому реакцией на повреждение могла быть гипертрофия, но не гиперплазия кардиомиоцитов. Однако недавно получены доказательства, подтверждающие возможность естественной репарации миоцитов; при этом на протяжении жизни человека происходит обмен до 50% миоцитов, следовательно, система репарации клеток неадекватна при столь обширных повреждениях, как наблюдающиеся при ИБС и сердечной недостаточности. И все-таки способность сердца здорового человека генерировать новые миоциты позволяет предполагать, что разработка терапевтических стратегий, направленных на стимуляцию вышеописанных процессов, является весьма рациональной.

Несмотря на то, что концепция репарации миоцитов в теории достаточно проста, реализация потенциала методов лечения, основанных на данной концепции, является достаточно сложным процессом. «Дефицит миоцитов» при сердечной недостаточности вследствие ИМ, повлекшего за собой гибель около 25% миокарда левого желудочка, составляет ориентировочно 1 млрд. сердечных клеток. Чтобы клеточная терапия принесла успех, должна произойти не только регенерация сердечных клеток в указанном объеме, но и сократительная функция новых клеток должна быть синхронной и электромеханически связанной с васкулогенезом, обеспечивающим питание новых клеток.

Стволовые клетки: преимущества и недостатки различных типов клеток

В доклинических и клинических исследованиях в роли кандидатов для репарационной клеточной терапии рассматривались различные клетки (рис. 1). Клетки значительно отличаются друг от друга по анатомическому происхождению, строению и функциям, данные отличия характеризуются поверхностными маркерами, факторами транскрипции и экспрессированными протеинами. Они также отличаются своей способностью к формированию 1 или более типов дифференцированных клеток.

img 1

Рисунок 1. Преимущества и недостатки различных типов клеток, полученных из разных источников, использующихся как в клинических исследованиях, так и в эксперименте. ЭКП — эндотелиальная клетка-предшественник; ГСК — гематопоэтическая стволовая клетка; МСК — мезенхимальная стволовая клетка.

Эмбриональные стволовые клетки

Эмбриональная стволовая клетка, полученная из внутреннего листка развивающегося эмбриона, на протяжении стадии бластоцисты, обладает наибольшим потенциалом для регенерации органа и представляет собой прототип стволовой клетки. Эмбриональные стволовые клетки способны дифференцироваться до самых разнообразных типов клеток и тканей, включая кардиомиоциты; однако их природная склонность к плюрипотентной пролиферации сопряжена с повышенным риском тератомы. На животных моделях экспериментального ИМ и неишемической кардиомиопатии трансплантация эмбриональных стволовых клеток обеспечивала выраженное улучшение функции и структуры сердца и казалось, что новые клетки были электрически интегрированы в миокард. Потенциальной проблемой для клинического применения такого метода терапии является иммунологическое несоответствие эмбриональных стволовых клеток вследствие их алогенного происхождения. Кроме того, методы, при помощи которых получают эмбриональные стволовые клетки, затрагивают ряд социальных и этических аспектов, препятствующих получению эмбрионального материала как в доклинических, так и клинических исследованиях.

Внимание современных исследований стволовых клеток направлено на обеспечение дифференциации клеток до их клинического применения, при этом ведущей является концепция управляемого кардиопоэза, при котором имитируется естественная эмбриональная кардиогенная среда, для того, чтобы в результате получить популяцию сердечных клеток-предшественников. Молекулярной основой данного процесса является геномная и протеомная характеризация природных кардиоиндуцирующих сигналов, после которой применяется рекомбинантный подход, позволяющий достичь «управляемого кардиопоэза». В дополнение к сигнальным молекулам при данном подходе используется синергизм между ростовыми и трофическими факторами, таким образом удается воспроизвести влияние эндодермального секретома и направить бесконтрольную пластичность плюрипотентных стволовых клеток по специфическому миокардиальному пути, сводя к нулю вероятность неконтролированного роста. Данный процесс «управляемого развития» в настоящее время выходит на клиническую арену, а подобные подходы используются относительно мезенхимальных стволовых клеток (МСК), получаемых из костного мозга с целью стимуляции латентного кардиогенного потенциала фенотипа взрослых клеток. При альтернативной стратегии удается получить очищенные кардиомиоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, они свидетельствуют о хорошей выживаемости после имплантации, если проводится стимуляция прокардиогенными факторами и факторами, поддерживающими жизнеспособность. Кроме того, на основе биомаркеров предполагается ранняя кардиогенная спецификация в пределах пула стволовых клеток, что позволяет прицельно избирать кардиопоэтическую клеточную линию. Помимо замещения пораженных тканей эмбриональные стволовые клетки способны бороться с метаболическим дефицитом и восстанавливать разобщенные межклеточные взаимосвязи. Перечисленные положительные эффекты эмбриональных стволовых клеток могут стать ключевым компонентом регенеративной способности в моделях заболеваний человека, обеспечивая будущие направления регенеративной медицины.

Стволовые клетки взрослого: клетки, полученные из костного мозга

В отличие от плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, способность к дифференциации стволовых клеток взрослого человека более ограничена. Костный мозг — типичный источник стволовых клеток у взрослого человека, в нем образуются различные популяции клеток, способных к миграции и трансдифференциации в клетки различных фенотипов. Степень, до которой данные клетки способны дифференцироваться в кардиомиоциты, неизвестна, а результаты экспериментов, полученные на животных моделях, не всегда удается воспроизвести. Две основные подгруппы клеток костного мозга, а именно гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), можно и далее категоризировать в субпопуляции и классифицировать в зависимости экспрессии клеточных поверхностных маркеров. Клетки костного мозга получают путем прямой аспирации костного мозга или посредством забора периферической крови после цитокиновой мобилизации.

Гематопоэтические стволовые клетки. Как правило, данные клетки идентифицируются по экспрессии клеточных поверхностных антигенов CD34+ и CD133. ГСК изучены достаточно обстоятельно, они используются клинически для трансплантации костного мозга при различных гематологических заболеваниях. В крови и костном мозге были идентифицированы клетки, способные приобретать эндотелиальный фенотип. Эндотелиальные клетки-предшественники — гетерогенная популяция клеток, содержащихся преимущественно в костном мозге, вероятно, способствуют неоваскуляризации посредством секреции проангиогенных факторов роста и стимуляции реэндотелиализации; обе данные функции способствуют сосудистому гомеостазу и, вероятно, миогенезу.

Другие клетки, локализирующиеся в костном мозге (и не только), включают МСК, мультипотентные клетки-предшественники взрослого и вспомогательную популяцию клеток, которые определяются при помощи молекулярных механизмов. Данные о регенеративной способности перечисленных типов клеток основаны на находках, полученных в экспериментальных моделях животных, но не на клиническом опыте.

Еще предстоит установить, смогут ли клетки костного мозга или клеточные линии других источников в будущем дифференцироваться в миоциты. Если не удастся существенно улучшить эффективность существующих клеточных препаратов костного мозга, внимание исследователей, очевидно, переключится на другие источники клеток.

Мезенхимальные стволовые клетки. Это популяция клеток, присутствующих в тканях взрослого человека, таких как костный мозг и жировая ткань. МСК можно изолировать, а также легко расширить их популяцию и, как засвидетельствовали экспериментальные исследования, данный вид клеток может трансдифференцироваться в функциональные кардиомиоциты и ряд других клеток, обеспечивая улучшение функции левого желудочка и замедляя процессы ремоделирования. Они также способны модулировать иммунные реакции. Степень трансдифференциации в настоящее время изучается, однако накапливается все больше доказательств, свидетельствующих о положительном эффекте подсадки и дифференциации трансплантированных человеческих МСК в миокард овцы, находящийся в стадии заживления. Неинвазивные методы визуализации свидетельствуют, что терапия после острого ИМ аллогенными МСК способствует активной регенерации сердца in vivo.

Жировая ткань, полученная из эмбриональной мезенхимы, содержит МСК и эндотелиальные клетки-предшественники, а также жировые клетки. Экспериментальные данные свидетельствуют, что клетки, полученные из жировой ткани, способны трансдифференцироваться в клетки, обладающие свойствами кардиомиоцитов и, вероятно, кровеносных сосудов или, как минимум, неоваскулярной ткани. Жировые клетки достаточно привлекательны, поскольку они легко доступны и у большинства людей их достаточно. Однако необходимы дополнительные данные и доказательства их эффективности на животных моделях до применения в клинических условиях.

Кровяные клетки плода и пуповины

Благодаря своему пренатальному происхождению кровяные клетки плода и пуповины обладают большей пластичностью, нежели клетки взрослого, однако на сегодняшний день доказательства плюрипотентности после экспансии данных клеток in vitro отсутствуют. В пуповинной крови человека содержатся различные популяции клеток-предшественников, включая ГСК и МСК, помимо соматических стволовых клеток. Указанные клетки характеризуются пролиферативной способностью, однако в исследованиях на животных были получены спорные результаты в отношении улучшения функции левого желудочка. Данные клетки пока недостаточно изучены в клинических исследованиях.

Резидентные сердечные стволовые клетки

В сердце человека и других видов млекопитающих было идентифицировано несколько кластеров выживших резидентных сердечных стволовых клеток, или клеток-предшественников. Необходимы эксперименты, связанные с отслеживанием клеточных линий, чтобы точно определить происхождение данных клеток (экстракардиальное или интракардиальное). Их истинная роль в миокардиальном гомеостазе на протяжении жизни человека неизвестна; несмотря на то, что они обладают высоким пролиферативным потенциалом, его недостаточно для компенсации обширного повреждения, возникающего, например, при остром ИМ.

Кардиосферы — это сферические кластеры клеток, которые можно получить путем эндомиокардиальной биопсии. Они помещаются на специальные блюдца, в которых выращиваются в виде культуры, при этом удается получить клетки кардиосферного происхождения в дополнение к другим популяциям резидентных сердечных клеток-предшественников, включая клетки с-kit+. Недавнее исследование, проведенное с целью подтверждения данной концепции, засвидетельствовало, что кардиосферы, полученные из миокарда путем эндомиокардиальной биопсии, можно изолировать и вырастить из них культуру для экспансии, это может обеспечивать потенциально полезный источник аутологических сердечных стволовых клеток. Находки нескольких исследований, в которых использовались сердечные стволовые клетки с-kit+, подтвердили возможность проведения пересадки и благоприятное воздействие на функцию левого желудочка, замедление процесса ремоделирования и уменьшения площади ИМ на животных моделях. Однако не всегда удавалось воспроизвести положительные находки исследований. В ответ на повреждение при остром ИМ в миокарде выявляются клетки, экспрессирующие с-kit+ и другие кардиогенные маркеры, что подтверждает роль указанных клеток в репарационной способности тканей сердца. Упомянутые клетки также присутствуют на ранних стадиях развития сердца, поскольку их популяция гораздо многочисленнее в постнатальном периоде (1–2 недели после рождения) в противовес сердцу взрослого организма (эксперименты на мышах). Однако еще нет ответа на вопрос, станут ли специфические резидентные сердечные клетки-предшественники более эффективными, чем смесь клеток, включая клетки с-kit+, клетки SCA (stem сеll antigen) -1+, кардиосферы и др. В настоящее время планируются клинические исследования данной проблемы.

Скелетные миобласты

Скелетные миобласты являлись первыми клетками, вводившимися в ишемизированный миокард путем инъекции. Несмотря на сообщения об улучшении функции левого желудочка и уменьшении его объема (вероятно, из-за механического эффекта), практически нет доказательств того, что данные клетки способны трансдифференцироваться в кардиомиоциты. Кроме того, функция левого желудочка улучшается ненадолго, к тому же не наблюдается электрической интегрирации вышеупомянутых клеток в миокард, что может повышать риск аритмий. Наблюдение за небольшой группой пациентов с кардиомиопатией на протяжении 1 года, которым в рандомизированном контролированном исследовании вводились скелетные миобласты в миокард с помощью трехмерной катетерной системы, засвидетельствовало положительное воздействие на функцию левого желудочка, облегчение симптоматики и качества жизни. И все-таки, кажется, энтузиазм в отношении данного подхода угасает.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Недавно произошел значительный научный прорыв — из соматической ткани удалось генерировать популяцию клеток с признаками эмбриональных стволовых клеток. Соматической тканью являлись фибробласты взрослого с репрограммированными ядрами (происходила эктопическая экспрессия генов, связанных с плюрипотентностью). Данный революционный подход обеспечивает альтернативный эмбриональной ткани источник получения клеточных линий с кардиогенным потенциалом. Кроме того, данный подход можно использовать для создания специфических для пациента стволовых клеток, которые могли бы стать уникальным источником при исследовании генетических механизмов развития заболевания, эффектов препаратов и биологии регенерационного процесса. Недавнее исследование позволяет предположить, что использование жировых клеток, полученных методом липосакции у пациентов среднего возраста, значительно повышает эффективность индукции плюрипотентных стволовых клеток. С целью повышения безопасности данная революционная методика была недавно модифицирована, в частности, удалось внедрить безвирусные подходы к доставке генов. Недавно появилось сообщение о создании поколения плюрипотентных стволовых клеток человека путем прямой доставки репрограммирующих протеинов, не имеющих вирусных векторов ДНК. Клинические перспективы данных революционных концептуальных разработок еще предстоит выяснить, но потенциал поражает. При этом недавно удалось засвидетельствовать, что плюрипотентные стволовые клетки человека (индуцированные фибробласты) способны к дифференциации в функциональные миоциты.

Пути и методы доставки клеток

Принцип клеточной терапии — это репарация поврежденной ткани путем доставки адекватного числа клеток в зону интереса. Для достижения указанной цели необходим благоприятный микроклимат (для того, чтобы клетки успели прижиться в зоне повреждения) и другие факторы. Доступные в настоящее время пути введения клеток следующие — внутривенный, интракоронарный, трансмиокардиальный (непосредственная эпикардиальная инъекция), трансэндокардиальная инъекция при помощи катетера с использованием электромеханического вольтажного картирования и новейший подход — инъекция в коронарные вены (рис. 2). В настоящее время изучается метод интраперикардиальной доставки. Ни один из методов не засвидетельствовал преимуществ перед другими. Ключевым моментом также является время введения клеток после начала заболевания (например, острого ИМ) и первоначальная природа заболевания (ишемическая в противовес неишемической). В случае ИБС согласованное мнение относительно того, следует ли вводить клетки в область рубца, участок микрососудистой дисфункции или пограничную зону, отсутствует; правильный выбор места введения клеток в целом предопределяет оптимальную стратегию лечения в специфических подгруппах. Как правило, эффективность доставки клеток и задержка их в месте доставки ниже предполагаемых, а задержка клеток и их выживаемость в зоне доставки ограничены.

img 2

Рисунок 2. Методы доставки клеток при сердечной имплантации. А — внутривенное введение; Б — внутрикоронарная инфузия при помощи баллонного катетера (после восстановления проходимости артерии); С — трансэпикардиальная инъекция после торакотомии в зону, граничащую с инфарктом; Д — трансэндокардиальный подход с использованием электромеханического вольтажного картирования с целью определения жизнеспособности тканей; Е — внутривенная инъекция в коронарные вены через коронарный синус, которая позволяет доставлять клетки в зоны миокарда, кровоснабжающиеся окклюзионными коронарными артериями.

Доклинические и клинические исследования: значение результатов и механизмы положительных эффектов

Особенностью многих исследований на животных, доклинических и ранних клинических исследований, за исключением рандомизированных клинических испытаний, является практически полная универсальность относительно получения благоприятных результатов, а именно, увеличение фракции выброса, уменьшение объемов желудочков, площади ИМ и улучшение перфузии миокарда (рис. 3). При этом положительные эффекты отмечались при использовании всех типов клеток — как аллогенных, так и аутологических (внутрикардиального и экстракардиального происхождения). Кроме того, казалось, что данные эффекты не зависят от времени, истекшего после острого ИМ, этиологии (ишемическая или неишемическая), метода доставки и места доставки, а также количества введенных клеток. Дозы клеток, о которых сообщалось в исследованиях, отличались иногда в 6700 раз. Еще один отличительный признак исследований — это улучшение функции левого желудочка в пределах 72 часов — значительно раньше, чем можно было бы предполагать при клеточной регенерации какой-либо значимой степени.

На протяжении последнего десятилетия было много споров относительно способности стволовых клеток, полученных из костного мозга, и особенно ГСК, трансдифференциироваться в кардиомиоциты (рис. 4). Результаты исследований значительно изменили научные взгляды; в настоящее время общепризнано, что инъекция ГСК не приводит к дифференциации в кардиомиоциты, по меньшей мере, в физиологически и клинически значимых количествах, а задержка клеток в месте введения после первых нескольких дней минимальная. Однако недавнее генетическое исследование засвидетельствовало, что трансплантированные из костного мозга клетки способны индуцировать экспрессию кардиального гена, однако количество данных клеток, приобретающих кардиальный фенотип, невелико. Была предложена концепция слияния клеток (то есть трансплантированные клетки сливаются с другими клетками миокарда, в результате чего образуется гибридная клетка-предшественница с признаками дифференцированной клетки), которую удалось подтвердить in vitro, но клиническая значимость данной концепции вызывает сомнения и в целом считается, что ее недостаточно для влияния на сердечную регенерацию.

img 3

Рисунок 3. Концепция универсальности положительного эффекта, которая прослеживалась в экспериментах на животных и клинических исследованиях, за исключением нескольких недавних рандомизированных исследований с противоречивыми результатами. ЛЖ — левый желудочек; ФВЛЖ — фракция выброса левого желудочка; ИМ — инфаркт миокарда.

img 4

Рисунок 4. Схематическая иллюстрация потенциально благоприятных механизмов, лежащих в основе клеточной репаративной или клеточной регенеративной терапии. На сегодняшний день подходы сместились от непосредственных клеточных эффектов, вызывающих трансдифференциацию в кардиомиоциты, к цитокино-паракринным гипотезам. Основа современных гипотез состоит в том, что трансплантированные клетки или факторы, развившиеся в культуральной среде, активируют ангиогенез, уменьшают воспаление, улучшают метаболическую модуляцию и уменьшают апоптоз, что приводит к стимуляции репаративных и кардиопротекторных эффектов, а не к собственно регенерации миоцитов.

В настоящее время во многих лабораториях мира прицельно изучается способность других типов клеток (включая МСК, клетки, полученные из эмбриона, и резидентные сердечные клетки-предшественники, а также генетически перепрограммированные зрелые клетки взрослого) трансдифференцироваться в кардиомиоциты. Ключевым компонентом данных исследований является изучение сложных сигнальных механизмов, контролирующих процесс «управляемой дифференциации» в миоциты, что таким образом дает возможность популяции миокардиальных клеток обогатиться новыми клетками.

В настоящее время ученые пытаются объяснить парадокс: результаты многих исследований свидетельствуют о том, что клеточный трансплантат обеспечивает ряд положительных эффектов, однако данные о клинически или патофизиологически значимой трансдифференциации клеток, их задержке в месте введения и жизнеспособности отсутствуют. Хотя мы должны принимать во внимание данные недоразумения, однако доказательства эффективности нельзя отбрасывать только потому, что механизмы эффективности непонятны. Несмотря на то, что не удалось засвидетельствовать какую-либо значимую способность к регенерации при применении доступных в настоящее время популяций клеток, это не исключает возможности повышения эндогенной способности к репарации посредством ряда других механизмов, также это не означает и того, что продолжающиеся попытки регенерации миокарда обречены на провал.

Инъекция стволовых клеток в миокард может изменять форму желудочка и замедлять процесс ремоделирования через так называемый эффект «подмостков». Например, на животной модели инфаркта Dai и соавт. засвидетельствовали, что инъекция коллагена в ишемизированную стенку стимулирует процесс рубцевания и обеспечивает увеличение ударного объема, фракции выброса и уменьшает парадоксальное систолическое выпячивание ишемизированной стенки. Однако неизвестно, будут ли подобные эффекты возникать у человека.

В настоящее время ведущая концепция эффективности стволовых клеток сместилась в направлении цитокино-паракринной гипотезы (рис. 4). Исследования на животных засвидетельствовали, что инъекция среды, в которой проводилось культурирование МСК, сопровождалась улучшением функции левого желудочка и угнетением процессов апоптоза. Последние экспериментальные данные также свидетельствуют, что интерлейкин 10 из мононуклеарных клеток трансплантированного костного мозга способен значительно улучшать кардиопротекцию после острого ИМ. Другие цитокины и факторы роста из трансплантированных клеток-предшественников, обеспечивающие важные паракринные эффекты, включают сосудистый эндотелиальный фактор роста, фактор стромальных клеток, ангиопоэтин 1, фактор роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста 1, периостин и др. В будущем, вероятно, будет идентифицировано множество цитокинов и паракринных факторов, благоприятно влияющих на ангиогенез, воспаление, цитопротекцию, метаболическую модуляцию и апоптоз. Что теоретически возможно, но достаточно маловероятно, так это то, что данные паракринные факторы активируют или вовлекают резидентные сердечные стволовые клетки или индуцируют пролиферацию резидуальных миоцитов. Независимо от того, какой механизм в данном случае имеет место, интересно, что сохраняется возможность того, что клеточная репарационная терапия оказывает ключевые положительные эффекты независимо от какого-либо прямого воздействия данных клеток на регенерацию миоцитов. Однако данные положительные эффекты еще предстоит подтвердить в будущих исследованиях.

Клинические исследования: потенциал и подводные камни?

Клинические исследования — не преждевременны ли они?

В 2001 году появились первые сообщения, свидетельствовавшие о вероятной регенерации миокарда у животных при использовании клеток костного мозга. Примерно через 6 месяцев началось первое клиническое исследование данного вопроса. На современном этапе, учитывая отсутствие полного понимания механизмов, лежащих в основе дифференциации стволовых клеток в миокардиальные, а также механизмов явного положительного эффекта, возникает логичный вопрос: не являются ли клинические исследования в данной сфере преждевременными? Действительно, было предложено не начинать новые клинические исследования до получения ответов на ряд важных вопросов в экспериментальных условиях.

Однако существуют и серьезные аргументы в пользу продолжения тщательным образом спланированных и сфокусированных клинических исследований. В пользу продолжения таких исследований свидетельствуют серьезная клиническая потребность в таких методах лечения, положительные доклинические данные, а также возможный ранний клинический опыт относительно безопасности и эффективности. Исследования дают ответ на выдвинутые гипотезы, но они также порождают целый ряд новых вопросов. Имеется много прецедентов, свидетельствующих о вкладе клинических исследований в современное понимание действия препаратов, включая аспирин, статины, ингибиторы АПФ и антагонисты альдостерона. Кроме того, доклинические исследования на животных не смогут ответить на множество сложных вопросов относительно времени введения клеток и методов их доставки. Мы полагаем, что клинические исследования необходимо продолжать, но они должны быть сфокусированными и механистическими, чтобы обеспечить ответы на ключевые вопросы, включая безопасность такого лечения и механизмы положительных эффектов.

Результаты клинических исследований

Многообещающие результаты доклинических и ранних пилотных исследований запустили волну клинических исследований, отличавшихся методологической гетерогенностью, отсутствием стандартизации и однотипности. Хотя большинство исследований засвидетельствовало положительный эффект, в нескольких недавних исследованиях получены противоречивые результаты. Было проведено 4 метаанализа применения клеток, полученных из костного мозга взрослых пациентов, при остром ИМ. В целом результаты плацебо-контролированных исследований многообещающие в плане демонстрации возможности применения такого лечения, безопасности и достаточно умеренного положительного влияния на фракцию выброса левого желудочка (увеличение ФВЛЖ примерно на 3%). Также было засвидетельствовано умеренное снижение объема левого желудочка, уменьшение площади инфаркта (от –3,5% до –5,6%) и определенное улучшение регионарной функции. Кроме того, объемы введенных путем инъекции клеток коррелировали с изменениями ФВЛЖ, что предполагает наличие вероятной взаимосвязи между дозой и ответом на лечение. Наиболее выраженное улучшение отмечалось в зонах миокарда с наибольшей степенью повреждения или большим рубцом. В некоторых исследованиях был сделан вывод, что при трансплантации клеток костного мозга улучшается перфузия миокарда и резерв трансмурального коронарного кровотока, а также диастолическая функция. Однако исследование BOOST засвидетельствовало, что такое улучшение является кратковременным, следовательно, может потребоваться дополнительная инфузия клеток через неопределенный период времени.

Несколько неожиданно метаанализы засвидетельствовали тенденцию к снижению риска повторного ИМ, а исследование REPAIR-AMI с участием 204 пациентов (крупнейший проект на сегодняшний день), засвидетельствовало выраженное снижение смертности, частоты повторных госпитализаций по поводу сердечной недостаточности и необходимости повторной реваскуляризации.

Следует отметить, что общий положительный эффект на функцию левого желудочка, засвидетельствованный метаанализами, ставят под сомнение результаты 3 других исследований, либо не засвидетельствовавших положительный эффект, либо только начальный положительный эффект, продолжавшийся более 6 месяцев. Вполне логично предполагать, что влияние на функциональную способность клеток могут оказывать отличия в методиках изоляции и хранения клеток. В настоящее время данные методологические проблемы исследуются.

Различные авторы по-разному восприняли результаты первой фазы клинических исследований. Действительно, большинство трансплантированных клеток исчезает из миокарда в пределах первой недели, при этом нет никаких конкретных доказательств регенерации миоцитов. С другой стороны, исследования позволяют глубже изучать базисные механизмы, лежащие в основе положительного эффекта, а также разрабатывать новые стратегии, улучшающие жизнеспособность пересаженных клеток и степень их задержки в миокарде. Выявленная тенденция к улучшению функции левого желудочка, перфузии миокарда, ограничению площади ИМ в дополнение к очевидной безопасности такого лечения обнадеживает и порождает новые вопросы для следующей фазы клинических исследований. Возможно, предшествующий преувеличенный оптимизм изменился ощущением реальности и осознания многих проблем, которые необходимо решать.

Значительно меньше рандомизированных исследований, посвященных трансплантации стволовых клеток, полученных из крови или костного мозга, проводилось у пациентов с хронической ИБС и хронической сердечной недостаточностью. Их результаты подобны полученным у больных с острым ИМ (улучшение общей и регионарной функции левого желудочка, перфузии миокарда и облегчение стенокардии).

Нерешенные клинические вопросы

На сегодняшний день клиническое значение трансплантации стволовых клеток должно ограничиваться экспериментальными исследованиями или сфокусированными клиническими исследованиями. Уже проведенные доклинические и клинические исследования в определенной степени указали нам нужное направление, однако все еще остается достаточно много вопросов, на которые еще предстоит ответить в будущих исследованиях. В частности, на вопрос: оказывает ли клеточная терапия свои положительные эффекты посредством дифференцировки пересаженных клеток в миоциты или кровеносные сосуды либо через цитокин-паракринные механизмы, модулирующие метаболизм, инотропную функцию, апоптоз и воспаление (рис. 5)?

img 5

Рисунок 5. Общая цель текущих и предстоящих клинических исследований — улучшение понимания изученных на сегодняшний день клеточных линий до перехода к модификации клеток и оценке новых типов клеток. ЛЖ — левый желудочек; ИМ — инфаркт миокарда.

Ключевые клинические проблемы включают критерии отбора пациентов, влияние сопутствующих факторов, таких как пожилой возраст, диабет, курение или гипертензия, на жизнеспособность пересаженных клеток, время введения клеток после начала острого ИМ, а также потенциальное благоприятное влияние при неишемических сердечных заболеваниях. Другие важные вопросы касаются того, какие клетки следует пересаживать и в каких количествах; методы и оптимальные места доставки клеток; процедуры забора клеток и правила их хранения; повышение жизнеспособности клеток в зоне пересадки, а также вопросы безопасности. Учитывая гетерогенность популяции исследованных клеток, приоритетом являются исследования с непосредственным сравнением различных клеток и смесей клеток при контролированных состояниях (рис. 5).

В настоящее время 25 новых клинических исследований проводится в США и примерно столько же в Европе, однако не удалось достичь согласованного мнения относительно стандартизации методов, в частности забора клеток, их изоляции и подготовки к трансплантации. Welt и Losordo затронули вопрос о фармакокинетике/фармакодинамике клеточной терапии и привлекли внимание к дилемме, что считать дозой при таком лечении — количество доставленных клеток в зону интереса, количество клеток, изначально задержавшихся в целевой зоне, или же количество клеток, в конечном итоге прижившихся в ткани миокарда? Все три вопроса клинически важны и акцентируют внимание на необходимости новых методов оценки.

В нескольких клинических обсервационных исследованиях затрагивался ключевой вопрос: почему процессы репарации в сердце взрослого пациента неадекватны, несмотря на доказательства эндогенной или спонтанной мобилизации клеток-предшественников? В исследовании пациентов, перенесших острый ИМ, Leone и соавт. сообщили о взаимосвязи между концентрацией спонтанно мобилизированных клеток CD34+ из крови и последующим улучшением сократимости левого желудочка наряду с замедлением процесса ремоделирования. Чем больше степень мобилизации данных клеток, тем ощутимее положительный эффект на функцию левого желудочка. Недавнее небольшое исследование с участием больных острым ИМ засвидетельствовало спонтанную мобилизацию очень мелких эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности. Данные клетки, являющиеся эндогенными, аутологическими и немодифицированными, с признаками плюрипотентности, потенциально могли бы представлять тип клеток для использования при репарации сердца и, таким образом, стать мостиком над бездной, существующей между стволовыми клетками взрослого человека и эмбриональными стволовыми клетками. Вызовы и барьеры, касающиеся сердечной регенерации, довольно ощутимы, и неудивительно, что способность трансплантированных клеток к регенерации ограничена, учитывая «чужеродное» микроокружение в миокарде после острого инфаркта, характеризующееся воспалением, фиброзом и неадекватным ангиогенезом. Чтобы преодолеть перечисленные барьеры, необходим многогранный подход, основанный на улучшении функции и жизнеспособности пересаживаемых клеток, и модификации среды, в которую данные клетки доставляются.

Достаточное ли количество клеток забирается и мобилизируется? Не является ли слишком коротким период времени? Не препятствует ли микроваскулярное поражение пенетрации клеток в инфарктную зону? Не является ли микроокружение в зоне инфаркта чужеродным для имплантации введенных клеток, не будет ли оно отрицательно влиять на их жизнеспособность и не будут ли пересаженные клетки неблагоприятно взаимодействовать с миокардиальными и воспалительными клетками? Еще одной зоной интереса является снижение количества и функциональной способности эндотелиальных клеток-предшественников в связи с сопутствующими состояниями, а также возможность улучшения функционирования «больных» клеток перед трансплантацией. Экспериментальные исследования стратегий активации клеток позволили идентифицировать несколько новых интересных подходов к улучшению жизнеспособности, задержки в зоне интереса, интеграции и вживления пересаженных клеток. К таким подходам относятся: трансдукция клеток генами, улучшающими жизнеспособность, а также обработка клеток перед трансплантацией специальными мелкими молекулами, активирующими их. Другие подходы сосредоточены на предварительном лечении целевых тканей с целью улучшения интеграции клеток, их жизнеспособности и сохранения в нужном участке, поскольку интеграция стволовых клеток в зону интереса и их жизнеспособность очень чувствительны к клеточному окружению в соответствующей зоне. Такие потенциальные стратегии включают воздействие на целевую зону шоковыми волнами низкой энергии и введение факторов роста (например фактора стромальных клеток). Активация стволовых клеток посредством их генетической модификации перед трансплантацией обеспечивает альтернативный инновационный подход.

На выбор клеток, места их введения и метод доставки может повлиять первичный диагноз и патологический субстрат (например острый ИМ, ишемическая либо неишемическая кардиомиопатия или первичное сосудистое заболевание), а также время введения клеток после начала инфаркта миокарда.

Конечные точки клинических исследований

На рисунке 6 изображена иерархическая классификация клинических и механистических конечных точек, которую можно использовать при разработке дизайна исследований. Неопровержимым доказательством эффективности было бы снижение смертности и частоты случаев сердечной недостаточности. Одно такое исследование уже планируется (1400 пациентов), оно будет обладать достаточной для оценки влияния на данные конечные точки статистической мощностью. И все-таки на сегодняшний день фокус большинства исследований должен быть механистическим, в них следует использовать суррогатные конечные точки. К суррогатным конечным точкам относятся результаты оценки (при помощи различных визуализационных методов общей и регионарной функции левого желудочка) ремоделирования и измерения площади ИМ.

img 6

Рисунок 6. Иллюстрация иерархической классификации конечных точек в клинических исследованиях. ХСН — хроническая сердечная недостаточность; ЛЖ — левый желудочек. Звездочками указаны конечные точки в современных клинических исследованиях.

Безопасность

До настоящего времени результаты, касающиеся безопасности клеточной терапии, были обнадеживающими, однако необходимо учитывать, что число пациентов в отдельных исследованиях было небольшим, а также то, что задержка клеток и их жизнеспособность в миокарде через 1 неделю после введения являются минимальными. В том случае, когда усилия, направленные на интеграцию клеток в зоне интереса, повышение их жизнеспособности, ускорение роста и усиление регенеративной способности, станут успешными, одним из приоритетов станет безопасность лечения.

Аритмогенез. Продолжаются споры относительно проаритмогенности стволовых клеток. В нескольких ранних исследованиях были засвидетельствованы случаи злокачественных желудочковых аритмий после трансплантации скелетных миобластов. Доказательства свидетельствуют, что данный феномен может зависеть от времени и после 2–4 недель частота аритмий снижается. Остается непонятным, связаны ли аритмии с методами хирургической реваскуляризации и доставки клеток или с исходным ишемическим субстратом. Следует еще установить проаритмогенность других типов клеток. Проведенные до настоящего времени исследования не засвидетельствовали проаритмогенных эффектов, кроме того, среди пациентов, получивших клеточную терапию, внезапная сердечная смерть случалась реже. И все-таки концептуально потенциал для усиления аритмогенеза существует. Важными факторами могут являться эффективность межклеточного сцепления, электрическая гетерогенность в результате неполной дифференциации клеток и др.

Онкогенная трансформация. Несмотря на большое количество экспериментальных доказательств онкогенной трансформации, особенно касательно эмбриональных и других плюрипотентных стволовых клеток, в клинических исследованиях не засвидетельствован рост частоты опухолей.

Мультиорганное обсеменение. Клетки, вводящиеся интракоронарно, обнаруживаются в селезенке, легких и печени. До сих пор такие находки не являлись клинически значимыми, но могут стать таковыми, если число выживших клеток значительно увеличится.

Аберрантная дифференциация клеток. Плюрипотентность означает, что клетки способны дифференцироваться в различные типы клеток. На модели острого ИМ у мышей непосредственная интрамиокардиальная инъекция неселектированных клеток костного мозга приводила к выраженной интрамиокардиальной кальцификации, а после введения МСК — к формированию костной ткани. Такие данные свидетельствуют о потенциальных рисках терапии стволовыми клетками, которые у людей еще предстоит исследовать.

Философские и этические проблемы

Станет ли терапия стволовыми клетками важной частью терапевтического арсенала при лечении сердечно-сосудистых заболеваний? Пока сомнительно. Клинические исследования у людей засвидетельствовали положительную тенденцию, кроме того, на некоторых животных моделях выявлены экстраординарные положительные эффекты. Но уместным является сдержанный оптимизм. Например, полезный урок можно извлечь из развития ангиогенеза и методов генной терапии. Первый пациент был включен в клиническое исследование в 1994 году, однако после примерно 11 клинических исследований, продолжавшихся 14 лет, ни один сердечно-сосудистый генный препарат не доказал клиническую эффективность.

Терпение общественности и организаций, спонсорирующих исследование, ограничено, а исследования стоят очень дорого.

В целом, фундаментальные регуляторные и этические требования к исследованию препаратов и других клинических исследований также относятся и к методам клеточной терапии. Однако исследование клеточной терапии порождает новые этические проблемы, включающие использование эмбрионального материала для исследований.

Другие проблемы включают вопросы собственности клеточных линий, интеллектуальной собственности, патентов и тому подобное. Поскольку использование аутологических стволовых клеток пациентов не имеет прямой связи с интеллектуальной собственностью, финансирование исследований стволовых клеток биотехнологическими компаниями ограничивается либо технологиями изоляции клеток, либо устройствами для доставки клеток. Однако данная ситуация может измениться, когда появятся новые линии стволовых клеток, не являющихся аутологическими, а также уникальные методы обработки клеток. Тогда на повестку дня выйдут проблемы собственности, контроля цены и доступности клеточных линий. На сегодняшний день дорогие рандомизированные клинические исследования финансируются преимущественно за счет нечастных организаций.

Вывод

Выход клеточной терапии, направленной на репарацию сердца, на клиническую арену достаточно интригующий. Следует еще установить, каким будет будущее такого лечения: регенерация миоцитов или восстановление сердца и его защита посредством вовлечения клеточных, аутокринных и паракринных механизмов, уменьшающих апоптоз и активирующих васкулогенез, инотропную функцию и метаболическую модуляцию. Вероятно, ключом к будущему терапии стволовыми клетками является понимание геномных и протеомных субстратов, модифицирующих ряд сигнальных систем, вовлеченных в трансформацию плюрипотентной клетки в миоцит. Доказательства трансдифференциации клеток в миоциты, полученные до настоящего времени, вызывают разочарование, однако это еще не означает, что цель абсолютно нереальная. Данная область медицины только начала развиваться, поэтому использование различных типов клеток, управляемого их развития и лучшее понимание механистических концепций еще может принести свои плоды. Трансдифференциация происходит, однако с очень низкой частотой, тем не менее, по-видимому, данный неэффективный процесс можно стимулировать методами воздействия на клетку и субстрат. Перспективным является сочетание генной и клеточной терапии, доказательством чего служит трансдукция генов в стволовых клетках с целью модификации их задержки и стимуляции жизнеспособности в зоне интереса. Также изучаются перспективы использования стволовых клеток как векторов для доставки препаратов и как моделей для понимания основ биологии заболевания.

Подготовил Владимир Павлюк