ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

ТЕРАПІЯ, СПРЯМОВАНА НА РЕПАРАЦІЮ СЕРЦЕВИХ КЛІТИН:
КЛІНІЧНА ПЕРСПЕКТИВА

Скорочений виклад

B. J. Gersh, R. D. Simari, A. Behfar et al.
Mayo Clin Proc 2009;84(10):876-892

У цьому огляді методів терапії, спрямованих на репарацію серцевих клітин, зроблено спробу представити клінічну перспективу й окреслити наукові проблеми, які лежать в основі експериментальних і клінічних досліджень, висвітлити результати рандомізованих контрольованих клінічних досліджень і дизайн майбутніх досліджень, а також обговорити етичні та філософські питання, що стосуються цієї проблеми.

Репарацію серцевих клітин (серцеву репарацію) можна розглядати як наслідок трьох основних процесів: заміна (тканинний трансплантат), омолодження або відновлення (активація резидентних серцевих стовбурових клітин чи інших стовбурових клітин через паракринні чи автокринні механізми; модуляція апоптозу, запалення, ангіогенезу чи метаболізму) і регенерація (імплантація клітин-попередників чи стовбурових клітин, з яких формуються диференційовані міоцити). Може бути використаний і комбінований підхід із залученням різних процесів, наприклад, спочатку застосовується модуляція міокардіального пошкодження, а після того наступний етап — метод терапії, спрямований на регенерацію міокарда.

Клінічна потреба

Існує висока клінічна потреба в нових методах терапії серцево-судинних захворювань, включаючи підходи до захисту, відновлення і регенерації серцевих клітин. Незважаючи на поліпшення методів лікування в гострій стадії і позитивний вплив методів первинної і вторинної профілактики, ішемічна хвороба серця (ІХС) залишається лідируючою причиною смерті у США, і те зниження показників смертності, яке почалося в 1960-х роках, дещо сповільнилось у 1990-х. У середньому протягом року в США реєструють 1 млн. гострих інфарктів міокарда (ІМ), і за 3 роки смертність у цих людей становить 25%. Приблизно 5 млн. пацієнтів у США мають серцеву недостатність, показники щорічної смертності в них становлять 20%. Крім того, трансплантація серця ніколи не задовольнить потреб пацієнтів у цьому методі лікування, оскільки трансплантація лімітується обмеженою кількістю донорів, а методи ксенотрансплантації залишаються експериментальними.

Огляд наукової проблеми

Якщо розглядати методи клітинної терапії концептуально, то вони дуже привабливі. Щодо патологічних станів, які характеризуються втратою міоцитів, таких як ІМ і серцева недостатність, існує постулат про те, що нежиттєздатний міокард можна піддати процесам регенерації чи репарації шляхом доставки туди стовбурових клітин чи клітин-попередників із різноманітних джерел, включаючи й саме серце. Традиційно кардіоміоцит розглядали як остаточно диференційовану клітину, і реакцією на пошкодження могла бути гіпертрофія, але не гіперплазія кардіоміоцитів. Однак недавно отримано докази, які підтверджують імовірність того, що існує природна система репарації міоцитів; проте протягом нормального проміжку життя людини відбувається обмін менше ніж 50% міоцитів і система репарації міоцитів неадекватна при таких обширних пошкодженнях, які виникають при ІХС чи серцевій недостатності. І все ж таки здатність серця здорової людини генерувати нові міоцити дає змогу зробити припущення, що раціональною є розробка терапевтичних стратегій, спрямованих на стимулювання цього процесу.

Хоча концепція репарації міоцитів у теорії досить прямолінійна, реалізація потенціалу терапевтичних стратегій, які базуються на цій концепції, надзвичайно комплексна. «Дефіцит міоцитів» при серцевій недостатності, яка виникла внаслідок ІМ, що спричинив втрату приблизно 25% міокарда лівого шлуночка, становить орієнтовно 1 млрд. серцевих клітин. Щоб клітинна терапія була успішною, мусить відбутися не лише регенерація серцевих клітин у такому масштабі, а й скорочення нових клітин повинно бути синхронним і електромеханічно поєднаним із васкулогенезом, який повинен забезпечити харчування цих нових клітин.

Стовбурові клітини: переваги і недоліки різних типів клітин

У доклінічних і клінічних дослідженнях у ролі кандидатів для репараційної клітинної терапії розглядалися різні клітини (рис. 1). Клітини суттєво відрізняються стосовно місця свого походження, а також анатомії і функції, і ці відмінності характеризуються поверхневими маркерами, факторами транскрипції й експресованими протеїнами. Вони також відрізняються стосовно своєї здатності формувати 1 чи більше типів диференційованих клітин.

img 1

Рисунок 1. Переваги і недоліки різних типів клітин, ізольованих із різних джерел, які використовують як у клінічних дослідженнях, так і в експерименті. ЕКП — ендотеліальна клітина-попередник; ГСК — гематопоетична стовбурова клітина; МСК — мезенхімальна стовбурова клітина.

Ембріональні стовбурові клітини

Ембріональна стовбурова клітина, яку отримують із внутрішнього масиву ембріона, що розвивається, протягом стадії бластоцисти, має найбільший потенціал для регенерації органа і є прототипною стовбуровою клітиною. Ембріональні стовбурові клітини можуть розвиватись у найрізноманітніші типи клітин і тканин, включаючи кардіоміоцити; однак їх природна схильність до плюрипотентної проліферації також призводить до підвищеного ризику виникнення тератоми. На тваринних моделях експериментального ІМ і неішемічної кардіоміопатії трансплантат з ембріональних стовбурових клітин приводив до вираженого поліпшення функції і структури серця, і виглядало, що нові клітини були електрично інтегровані в міокард. Потенційною проблемою для клінічного застосування такого методу терапії є імунологічна невідповідність ембріональних стовбурових клітин унаслідок їх алогенного походження. Крім того, методи, за допомогою яких отримують ембріональні стовбурові клітини, торкаються соціальних та етичних аспектів, що перешкоджає процесу отримання цих клітин як у доклінічних, так і клінічних дослідженнях.

Основним фокусом сучасного дослідження стовбурових клітин, який націлений на забезпечення диференціації клітин до їх застосування, є концепція керованого кардіопоезу, при якому застосовують імітацію природного ембріонального кардіогенного середовища, щоб отримати популяцію серцевих клітин-попередників. Молекулярний фундамент цього процесу ідентифікується через геномну і протеомну характеризацію природних кардіоіндукуючих сигналів, а після цього створюється рекомбінантний підхід, що дає змогу досягти «керованого кардіопоезу». На доповнення до сигнальних молекул при цьому підході експлуатується синергізм між ростовими і трофічними факторами, щоб відтворити вплив ендодермального секретому і спрямувати некеровану пластичність плюрипотентних стовбурових клітин у напрямку специфічного міокардіального шляху, зводячи до нуля схильність до неконтрольованого росту. Цей процес «керованого розвитку» в наш час переводиться на клінічну арену, і подібні підходи застосовують щодо мезенхімальних стовбурових клітин (МСК), що їх отримують із кісткового мозку, для підсилення латентного кардіогенного потенціалу фенотипу дорослих клітин. При альтернативній стратегії генерують очищені кардіоміоцити, які отримані з людських ембріональних стовбурових клітин і які демонструють добре виживання після імплантації, якщо виконують стимулювання прокардіогенними факторами і факторами, які сприяють виживанню. Крім того, на основі біомаркерів передбачають ранню кардіогенну специфікацію в межах пулу стовбурових клітин, що дає змогу прицільно обирати кардіопоетичну лінію клітин. На доповнення до заміщення уражених тканин ембріональні стовбурові клітини можуть перебороти метаболічні дефіцити і відновити роз’єднані міжклітинні взаємодії. Наведені тут позитивні ефекти ембріональних стовбурових клітин можуть стати критичним компонентом регенеративних можливостей у моделях захворювань людини, забезпечуючи майбутні напрямки регенеративної медицини.

Стовбурові клітини дорослого: клітини, які отримують із кісткового мозку

На відміну від плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин стовбурові клітини дорослого демонструють більш обмежену здатність до диференціації. Кістковий мозок — типове джерело стовбурових клітин у дорослої людини, яке містить різні популяції клітин, що мають потенціал до міграції і трансдиференціації у клітини різних фенотипів. Ступінь, до якого ці клітини можуть диференціюватись у кардіоміоцити, невідомий, і знахідки, отримані на тваринних моделях, не завжди вдавалося відтворити. Дві основні підгрупи клітин кісткового мозку, а саме гематопоетичні стовбурові клітини (ГСК) і мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), можуть і надалі категоризуватись у субпопуляції і стратифікуватись за експресією клітинних поверхневих маркерів. Клітини кісткового мозку можуть бути ізольовані шляхом безпосередньої аспірації кісткового мозку або їх отримують із периферичної циркуляції після цитокінової мобілізації.

Гематопоетичні стовбурові клітини. Переважно ці клітини ідентифікують за експресією клітинних поверхневих антигенів CD34+ і CD133. ГСК вивчені досить докладно і їх використовують клінічно для трансплантації кісткового мозку з приводу різноманітних гематологічних захворювань. У крові і кістковому мозку було ідентифіковано клітини, які здатні набувати ендотеліального фенотипу. Ендотеліальні клітини-попередники, гетерогенна популяція клітин, які містяться переважно у кістковому мозку, імовірно, сприяють неоваскуляризації через секрецію проангіогенних факторів росту і через стимуляцію реендотеліалізації; обидві ці функції можуть сприяти судинному гомеостазу і, ймовірно, міогенезу.

Інші клітини, які локалізуються в кістковому мозку (але не лише там), включають МСК, мультипотентні клітини-попередники дорослого і побічну популяцію клітин, які визначаються через молекулярні механізми. Потенціальна регенеративна роль цих типів клітин базується на знахідках, отриманих в експериментальних моделях тварин, але не на клінічному досвіді.

Ще необхідно встановити, чи клітини кісткового мозку або клітинні лінії з інших джерел зможуть у майбутньому приводити до формування міоцитів. Якщо не вдасться суттєво підвищити ефективність існуючих клітинних препаратів із кісткового мозку, увага дослідників очевидно переключиться на інші джерела клітин.

Мезенхімальні стовбурові клітини. Це популяція клітин, які присутні у тканинах дорослої людини, включаючи кістковий мозок і жирові тканини. МСК можна ізолювати і легко розширити їх популяцію і, як засвідчили експериментальні дослідження, вони можуть трансдиференціюватись у функціональні кардіоміоцити і різноманітні інші клітини, викликаючи поліпшення функції лівого шлуночка і послаблюючи процес ремоделювання. Вони також можуть модулювати імунні реакції. Ступінь трансдиференціації нині досліджується, але є все більше доказів, які свідчать про позитивний ефект підсадки і диференціації трансплантованих людських МСК у міокард вівці, який перебуває у стадії загоєння. Неінвазивні методи візуалізації свідчать, що терапія після гострого ІМ алогенними МСК сприяє in vivo активній регенерації серця.

Жирова тканина, отримана з ембріональної мезенхіми, містить МСК та ендотеліальні клітини-попередники, а також жирові клітини. Експериментальні дані свідчать, що клітини, отримані з жирової тканини, можуть трансдиференціюватись у клітини, які мають характеристики кардіоміоцитів і, ймовірно, кров’яних судин чи принаймні неоваскулярної тканини. Жирові клітини досить привабливі, оскільки до них легкий доступ і в більшості людей їх є достатньо. Проте необхідна додаткова характеризація і засвідчення їх ефективності на тваринних моделях до того, як буде встановлено клінічну роль цих клітин.

Кров’яні клітини плода і пуповини

Унаслідок їх пренатального походження кров’яні клітини плода і пуповини можуть мати більшу пластичність, ніж клітини дорослого, однак на сьогодні немає доказів плюрипотентності після експансії цих клітин in vitro. Кров із пуповини людини містить різноманітні популяції клітин-попередників, включаючи ГСК і МСК, на доповнення до популяції соматичних стовбурових клітин. Названі клітини мають проліферативний потенціал, але дослідження на тваринах дали конфліктні результати стосовно поліпшення функції лівого шлуночка. Ці клітини ще недостатньо вивчені у клінічних дослідженнях.

Резидентні серцеві стовбурові клітини

У серці людини та інших видів ссавців було ідентифіковано кілька кластерів резидентних серцевих стовбурових клітин, які вижили, або клітин-попередників. Необхідні експерименти з відстеження клітинних ліній, щоб точно визначити, чи ці клітини мають екстракардіальне, чи інтракардіальне походження. Їх справжня роль у міокардіальному гомеостазі протягом життя людини невідома; хоча вони й мають високий проліферативний потенціал, його недостатньо, щоб компенсувати обширне пошкодження, яке виникає, наприклад, при гострому ІМ.

Кардіосфери — це сферичні кластери клітин, які можна отримати за допомогою ендоміокардіальної біопсії. Їх поміщують на спеціальні блюдця і вирощують у вигляді культури, отримуючи при цьому клітини кардіосферного походження на доповнення до інших популяцій резидентних серцевих клітин-попередників, включаючи клітини с-kit+. Недавнє дослідження, проведене з метою підтвердження цієї концепції, засвідчило, що кардіосфери, які отримували з міокарда шляхом ендоміокардіальної біопсії, можна ізолювати, виростити з них культуру для експансії і це може забезпечувати потенціально корисне джерело аутологічних серцевих стовбурових клітин. Знахідки кількох досліджень, в яких використовувалися серцеві стовбурові клітини с-kit+, засвідчують можливість виконання пересадки і позитивний ефект на функцію лівого шлуночка, послаблення процесу ремоделювання і зменшення розміру ІМ на тваринних моделях. Однак не завжди вдавалося відтворити позитивні знахідки досліджень. У відповідь на пошкодження при гострому ІМ у міокарді виявляють клітини, які експресують с-kit+ та інші кардіогенні маркери, що підтверджує роль цих клітин у репарації серця. Також такі клітини присутні на ранніх стадіях розвитку серця, оскільки популяція цих клітин суттєво збільшена в постнатальному серці (1–2 тижні після народження) на противагу дорослому серцю (експерименти на мишах). Однак ще немає відповіді на питання, чи специфічні резидентні серцеві клітини-попередники будуть більш ефективними, ніж суміш клітин, включаючи клітини с-kit+, клітини SCA (stem cell antigen)-1+, кардіосфери та ін. Нині плануються клінічні дослідження.

Скелетні міобласти

Скелетні міобласти були першими клітинами, які вводили в ішемізований міокард шляхом ін’єкції. Хоча й були повідомлення про поліпшення функції лівого шлуночка і зменшення його об’єму (імовірно, через механічний ефект), практично немає доказів того, що ці клітини можуть трансдиференціюватись у кардіоміоцити. Крім того, поліпшення функції лівого шлуночка не є тривалим і ці клітини не стають електрично інтегрованими в міокард, що може сприяти схильності до виникнення аритмій. Спостереження протягом 1 року за невеликою групою пацієнтів із кардіоміопатією, яким у рандомізованому контрольованому дослідженні вводили скелетні міобласти в міокард за допомогою тривимірної катетерної системи, засвідчило позитивний ефект стосовно функції лівого шлуночка, полегшення симптомів і якості життя. І все ж таки виглядає, що ентузіазм стосовно цього підходу спадає.

Індуковані плюрипотентні стовбурові клітини

Недавно було зроблено суттєвий науковий прорив — із соматичної тканини вдалося генерувати популяції клітин із характеристиками, що нагадують ембріональні стовбурові клітини. Соматичною тканиною були фібробласти дорослого, щодо них застосовували ядерне репрограмування через ектопічну експресію генів, пов’язаних із плюрипотентністю. Цей революційний підхід забезпечує альтернативне джерело, з якого можна генерувати клітинні лінії з кардіогенним потенціалом, не використовуючи ембріони. Крім того, ця стратегія може бути використана для створення специфічних для пацієнта стовбурових клітин, які могли би бути унікальним джерелом при дослідженні генетичних механізмів розвитку захворювання, дії препаратів та біології регенераційного процесу. Недавнє дослідження дає змогу припустити, що використання жирових клітин, отриманих методом ліпосакції в пацієнтів середнього віку, суттєво підвищує ефективність індукції плюрипотентних стовбурових клітин. Щоб поліпшити безпеку, цю революційну методику недавно модифікували, ввівши безвірусні підходи до доставки генів. Недавно з’явилося повідомлення, що вдалося створити генерацію індукованих у людини плюрипотентних стовбурових клітин шляхом безпосередньої доставки репрограмуючих протеїнів, які не мають вірусних векторів ДНК. Клінічні перспективи цих революційних концептуальних розробок ще треба визначити, але потенціал вражає. Адже недавно вдалося засвідчити, що індуковані в людини плюрипотентні стовбурові клітини (індуковані фібробласти) можуть диференціюватися у функціональні міоцити.

Шляхи і методи доставки клітин

Стратегія клітинної терапії — це репарація пошкодженої тканини через доставку адекватної дози клітин до ділянки інтересу. Щоб досягти цієї мети, необхідне сприятливе мікрооточення (для виживання і затримки клітин у місці пошкодження) та інші фактори. Доступні нині шляхи введення клітин такі внутрішньовенний, інтракоронарний, трансміокардіальний (безпосередня епікардіальна ін’єкція), трансендокардіальна ін’єкція на основі катетера з використанням електромеханічного вольтажного картування і найновіший підхід — черезвенозна ін’єкція в коронарні вени (рис. 2). Нині досліджується метод інтраперикардіальної доставки. Жодна стратегія не стала такою, якій віддають перевагу перед іншими. Ключовим моментом також є час введення клітин щодо початку захворювання (наприклад гострого ІМ) і вихідний субстрат захворювання (ішемічне на противагу неішемічному). У випадку ІХС ще немає консенсусу стосовно того, чи клітини треба вводити в ділянку рубця, ділянку мікросудинної дисфункції чи пограничну зону; відповідне місце введення клітин може бути важливою детермінантою оптимальної стратегії у специфічних підгрупах. Загалом ефективність доставки клітин і затримка їх у місці доставки нижчі, ніж очікували, і затримка клітин та їх виживання у місці доставки обмежені.

img 2

Рисунок 2. Методи доставки клітин при серцевій імплантації. А — внутрішньовенне введення; Б — внутрішньокоронарна інфузія з використанням балонного катетера (після відновлення прохідності артерії); В — трансепікардіальна ін’єкція після торакотомії в пограничну зону інфаркту; Г — трансендокардіальний підхід із використанням електромеханічного вольтажного картування, щоб визначити життєздатність тканин; Д — внутрішньовенна ін’єкція в коронарні вени через коронарний синус, що дає змогу доставити клітини в ділянки міокарда, які обслуговувалися тепер оклюзованими коронарними артеріями.

Доклінічні та клінічні дослідження: значення результатів і механізми позитивного ефекту

Особливою рисою багатьох досліджень на тваринах, доклінічних і ранніх клінічних досліджень, за винятком рандомізованих клінічних досліджень, є майже універсальність щодо отримання позитивних результатів, а саме поліпшення фракції викиду, зменшення об’ємів шлуночків, розміру ІМ і поліпшення перфузії міокарда (рис. 3). При цьому позитивні ефекти відзначалися при застосуванні всіх типів клітин — як алогенних, так і аутологічних (аутологічних клітин як внутрішньокардіального, так і екстракардіального походження). Мало того, виглядало, що ці ефекти не залежать від часу, який минув після гострого ІМ, етіології (ішемічна чи неішемічна), методу доставки і місця доставки, а також кількості клітин, які були введені. Дози клітин, про які повідомляли в дослідженнях, відрізнялись іноді в 6700 разів. Ще одна вражаюча риса досліджень — це виявлення поліпшення функції лівого шлуночка в межах 72 годин — значно раніше, ніж можна було б очікувати для клітинної регенерації якогось значущого ступеня.

img 3

Рисунок 3. Концепція універсальності позитивного ефекту, яку відзначили в експериментах на тваринах і клінічних дослідженнях, за винятком кількох недавніх рандомізованих досліджень, у яких повідомлено суперечливі результати. ЛШ — лівий шлуночок; ФВЛШ — фракція викиду лівого шлуночка; ІМ — інфаркт міокарда.

Протягом останнього десятиліття було багато дебатів стосовно того, чи стовбурові клітини, отримані з кісткового мозку, і особливо ГСК можуть трансдиференціюватись у кардіоміоцити (рис. 4). Результати досліджень суттєво змінили наукові погляди; нині є загальновизнаним, що ін’єкція ГСК не приводить до диференціації в кардіоміоцити, принаймні в тих кількостях, які би були фізіологічно і клінічно значущими, і затримка клітин у місці введення після перших кількох днів мінімальна. Однак недавнє генетичне дослідження засвідчило, що трансплантовані клітини з кісткового мозку можуть індукувати експресію кардіального гена, хоча кількість цих клітин, які набувають кардіального фенотипу, низька. Було висунуто концепцію злиття клітин (тобто трансплантовані клітини зливаються з іншими клітинами міокарда, унаслідок чого виникає гібридна клітина-попередник із маркерами диференційованої клітини), яку вдалося підтвердити in vitro, але клінічна значущість цієї концепції викликає сумніви і загалом вважають, що вона недостатня, щоб мати вплив на серцеву регенерацію.

img 4

Рисунок 4. Схематична ілюстрація потенційно сприятливих механізмів, що лежать в основі клітинної репаративної чи клітинної регенеративної терапії. Концепції, що переважають сьогодні, змістились від безпосередніх клітинних ефектів, які викликають трансдиференціацію в кардіоміоцити, до цитокіно-паракринних гіпотез. Основу сучасних гіпотез становить те, що трансплантовані клітини чи фактори, які розвинулись у культуральному середовищі, підсилюють ангіогенез, послаблюють запалення, поліпшують метаболічну модуляцію і зменшують апоптоз, що приводить до посилення репаративних і кардіопротективних реакцій, а не до власне регенерації міоцитів.

Нині в багатьох лабораторіях світу прицільно досліджують те, чи інші типи клітин, включаючи МСК, клітини, отримані з ембріона, і резидентні серцеві клітини-попередники, а також генетично перепрограмовані зрілі клітини дорослого можуть трансдиференціюватись у кардіоміоцити. Ключовим компонентом цих зусиль є з'ясування комплексних сигнальних механізмів, які контролюють процес «керованого розвитку» в міоцити, що таким чином дає змогу популяції міокардіальних клітин збагатитися новими клітинами.

Нині науковці намагаються рогадати парадокс: дані багатьох досліджень свідчать про те, що клітинний трансплантат викликає багато позитивних ефектів, але відсутні дані про клінічно чи патофізіологічно значущу трансдиференціацію клітин, їх затримку в місці введення чи їх виживання. Хоча ми повинні брати до уваги ці непорозуміння, проте докази ефективності не можна відкидати тільки тому, що механізми цієї ефективності незрозумілі. Хоч і не вдалося засвідчити якоїсь значущої здатності до регенерації при застосуванні доступних нині популяцій клітин, це не виключає потенціалу щодо підсилення ендогенної можливості репарації через різноманітні інші механізми, також це не означає й того, що триваючі зусилля посилити регенерацію міокарда приречені на невдачу.

Ін’єкція стовбурових клітин у міокард може змінювати геометрію шлуночка і послаблювати процес ремоделювання через так званий ефект «підмостків». Наприклад, на тваринній моделі інфаркту Dai зі співавт. засвідчили, що ін’єкція колагену в інфарктовану стінку приводить до посилення рубця і викликає поліпшення ударного об’єму, фракції викиду і зменшує парадоксальне систолічне випинання інфарктованої стінки. Однак невідомо, чи подібні ефекти будуть виникати в людини.

Нині превалююча концепція ефективності стовбурових клітин змістилась у напрямку цитокіно-паракринної гіпотези (рис. 4). Дослідження на тваринах засвідчили, що ін’єкція середовища, в якому проводили культурування МСК, викликає поліпшення функції лівого шлуночка і зменшує апоптоз. Недавні експериментальні дані також свідчать, що інтерлейкін 10 із мононуклеарних клітин трансплантованого кісткового мозку може суттєво сприяти кардіопротекції після гострого ІМ. Інші цитокіни і фактори росту із трансплантованих клітин-попередників, які можуть чинити важливі паракринні ефекти, включають судинний ендотеліальний фактор росту, фактор, отриманий із стромальних клітин, ангіопоетин 1, фактор росту гепатоцитів, інсуліноподібний фактор росту 1, періостин та ін. У майбутньому, імовірно, буде ідентифіковано багато цитокінів і паракринних факторів, які сприятливо впливають на ангіогенез, запалення, цитопротекцію, метаболічну модуляцію й апоптоз. Що теоретично можливо, але досить малоймовірно, то це те, що ці паракринні фактори активують або рекрутують резидентні серцеві стовбурові клітини чи індукують проліферацію резидуальних міоцитів. Незалежно від того, який точний механізм тут залучено, існує інтригуюча можливість того, що клітинна репаративна терапія чинить основні позитивні ефекти незалежно від будь-якого прямого ефекту цих клітин на регенерацію міоцитів. Однак ці позитивні ефекти ще треба підтвердити майбутніми дослідженнями.

Клінічні дослідження: потенціал і підводні камені

Клінічні дослідження — чи не є вони передчасними?

У 2001 році з’явилися перші повідомлення, які засвідчували імовірну регенерацію міокарда у тварин при використанні клітин, отриманих із кісткового мозку. Приблизно через 6 місяців розпочалося перше з багатьох клінічних досліджень. Враховуючи відсутність розуміння на сучасному етапі механізмів, які лежать в основі диференціації стовбурових клітин у міокардіальні клітини, а також механізмів явного позитивного ефекту, постає логічне питання: чи не є клінічні дослідження передчасними в цій сфері? Справді, було запропоновано ввести мораторій на нові клінічні дослідження, доки не буде отримано відповідь на деякі важливі питання в експериментальних умовах.

Однак є й серйозні аргументи на користь продовження ретельно спланованих і сфокусованих клінічних досліджень. На користь продовження таких досліджень свідчить серйозна клінічна потреба в таких методах лікування, позитивні доклінічні дані, а також можливий ранній клінічний досвід стосовно безпеки й ефективності. Дослідження дають відповідь на висунуті гіпотези, але вони також породжують цілий діапазон нових запитань. Є багато прецедентів, які ілюструють внесок клінічних досліджень у наше сучасне розуміння дії препаратів, включаючи аспірин, статини, інгібітори АПФ і антагоністи альдостерону. Крім того, доклінічні дослідження на тваринах не зможуть відповісти на багато комплексних питань стосовно часу введення клітин і методів їх доставки. Ми вважаємо, що клінічні дослідження треба продовжувати, але вони повинні бути сфокусованими і механістичними, щоб можна було дати відповідь на ключові питання, включаючи безпеку такого лікування і механізми позитивного ефекту.

Результати клінічних досліджень

Багатообіцяючі результати доклінічних і ранніх пілотних досліджень запустили хвилю клінічних досліджень, які характеризувалися методологічною гетерогенністю, відсутністю стандартизації та відсутністю однотипності. Хоча більшість досліджень засвідчили позитивний ефект, кілька недавніх досліджень дали суперечливі результати. Було виконано 4 мета аналізи застосування клітин, отриманих із кісткового мозку дорослих пацієнтів при гострому ІМ. Загалом результати цих плацебо-контрольованих досліджень обіцяючі у плані того, що вони демонструють можливість застосування такого лікування, безпеку і досить помірний позитивний ефект на фракцію викиду лівого шлуночка (зростання ФВЛШ приблизно на 3%). Також засвідчено помірне зниження об’ємів лівого шлуночка, зменшення розміру зони інфаркту (від –3,5% до –5,6%) і деяке поліпшення регіонарної функції. Крім того, об’єми введених шляхом ін’єкції клітин корелювали зі змінами ФВЛШ, що допускає наявність імовірного зв’язку доза-відповідь. Найбільш виражене поліпшення відзначали в ділянках міокарда з найбільшим ступенем пошкодження чи обширністю рубцювання. У деяких дослідженнях зроблено висновок, що при трансплантації клітин кісткового мозку поліпшується перфузія міокарда і резерв трансмурального коронарного кровоплину, а також діастолічна функція. Однак дослідження BOOST засвідчило, що поліпшення досить короткотривале, отже, може бути необхідною додаткова інфузія клітин через невизначений період часу.

Дещо несподівано метааналізи засвідчили тенденцію в напрямку зниження частоти повторних ІМ, а в дослідженні REPAIR-AMI, в яке було залучено 204 пацієнти (найбільше на сьогодні), повідомлено про суттєве зниження смертності, частоти повторних госпіталізацій з приводу серцевої недостатності і повторних реваскуляризацій.

Треба відзначити, що загальний позитивний ефект, засвідчений метааналізами стосовно функції лівого шлуночка, ставлять під сумнів результати 3 інших досліджень, які або не засвідчили позитивного ефекту, або лише початковий позитивний ефект, який не підтримувався довше 6 місяців. Було зроблено цілком логічне припущення, що вплив на функціональну здатність клітин можуть мати відмінності в методиках ізоляції клітин і протоколів їх зберігання. Нині ці методологічні проблеми досліджуються.

Різні автори по-різному сприйняли результати цієї першої фази клінічних досліджень. Справді, більшість трансплантованих клітин зникають із міокарда у межах першого тижня і немає жодних конкретних доказів регенерації міоцитів. З іншого боку, дослідження дають змогу глибше вивчати базисні механізми, які лежать в основі позитивного ефекту, а також розробляти нові стратегії, які могли б поліпшити виживання пересаджених клітин і ступінь їх затримки в міокарді. Виявлена тенденція в напрямку поліпшення функції лівого шлуночка, перфузії міокарда, зменшення розміру ІМ на доповнення до очевидної безпеки такого лікування обнадіює і породжує нову серію питань для наступної фази клінічних досліджень. Можливо, попередній непомірний оптимізм змінився відчуттям реальності й усвідомлення багатьох проблем, які необхідно вирішити.

Значно меншу кількість рандомізованих досліджень трансплантації стовбурових клітин, отриманих із крові чи кісткового мозку, було виконано в пацієнтів із хронічною ІХС і хронічною серцевою недостатністю. Але результати подібні до результатів, отриманих у пацієнтів із гострим ІМ (поліпшення регіонарної і глобальної функції лівого шлуночка, перфузії міокарда і полегшення стенокардії).

Невирішені клінічні питання

На сьогодні клінічна роль трансплантації стовбурових клітин повинна обмежуватись експериментальними дослідженнями або сфокусованими клінічними дослідженнями. Уже проведені доклінічні і клінічні дослідження забезпечили нас певною дорожньою картою, однак для майбутніх досліджень залишається досить багато питань, на які ще немає відповіді. Це такі питання: клітинна терапія чинить свої позитивні ефекти через диференціацію пересаджених клітин у міоцити або кровоносні судини чи через цитокінові-паракринні механізми, які модулюють метаболізм, інотропізм, апоптоз і запалення (рис. 5)?

img 5

Рисунок 5. Загальна мета триваючих і майбутніх клінічних досліджень — ліпше зрозуміти наявні нині клітинні лінії до того, як переходити до модифікації клітин та оцінки нових типів клітин. ЛШ — лівий шлуночок; ІМ — інфаркт міокарда.

Ключові клінічні проблеми включають критерії селекції пацієнтів, вплив коморбідних станів, таких як літній вік, діабет, куріння чи гіпертензія, на функціональність пересаджених клітин, час введення клітин щодо початку гострого ІМ, а також потенційний позитивний вплив при неішемічних серцевих захворюваннях. Інші важливі питання стосуються того, які клітини слід пересаджувати і в яких кількостях; методи і оптимальні місця доставки клітин; процедури ізоляції клітин і їх зберігання; підсилення затримки і виживання клітин у місці пересадки, а також питання безпеки. Враховуючи гетерогенність популяції клітин, які досліджують, пріоритетними повинні бути безпосередні порівняння між різними клітинами і сумішами клітин при контрольованих станах (рис. 5).

img 6

Рисунок 6. Ілюстрація ієрархічної класифікації кінцевих точок у клінічних дослідженнях. ХСН — хронічна серцева недостатність; ЛШ — лівий шлуночок. Зірочками вказано кінцеві точки сучасних клінічних досліджень.

Нині 25 нових клінічних досліджень відбуваються у США і приблизно стільки ж у Європі, однак не було досягнуто жодного погодження стосовно стандартизації методів, особливо забору клітин, їх ізоляції і підготовки до трансплантації. Welt і Losordo порушили питання про фармакокінетику/фармакодинаміку клітинної терапії і привернули увагу до дилеми, що вважати дозою при такому лікуванні — кількість доставлених клітин у зону інтересу, кількість клітин, які спочатку затримались у межах цільової тканини, чи кількість клітин, які врешті-решт інкорпорувались у тканини міокарда? Усі три питання клінічно важливі й акцентують на потребі нових методів оцінки.

У кількох клінічних обсерваційних дослідженнях порушено ключове питання: чому репарація в серцях дорослих пацієнтів є неадекватною, незважаючи на докази ендогенної чи спонтанної мобілізації клітин-попередників? У дослідженні пацієнтів, які пережили гострий ІМ, Leone зі співавт. повідомили про кореляцію між концентрацією спонтанно мобілізованих клітин CD34+ у крові і подальшим поліпшенням скоротливості лівого шлуночка і сповільненням процесу ремоделювання. Чим більший ступінь мобілізації цих клітин, тим більший позитивний ефект на функцію лівого шлуночка. Недавнє невелике дослідження пацієнтів із гострим ІМ засвідчило спонтанну мобілізацію дуже маленьких ембріональних стовбурових клітин, які експресують маркери плюрипотентності. Ці клітини, які є ендогенними, аутологічними і немодифікованими і які мають маркери, що вказують на плюрипотентність, потенційно могли би представляти тип клітин для використання при репарації серця і, таким чином, стати містком над прірвою, яка існує між стовбуровими клітинами дорослої людини й ембріональними стовбуровими клітинами. Виклики і бар’єри перед серцевою регенерацією дуже значні, і не дивно, що регенеративна здатність трансплантованих клітин обмежена, враховуючи «вороже» мікрооточення в міокарді після гострого інфаркту, яке характеризується запаленням, фіброзом і неадекватним ангіогенезом. Щоб подолати через ці бар’єри, необхідний багатогранний підхід, який базується на підсиленні функції і виживання клітин, які пересаджуються, і модифікації середовища, в яке ці клітини доставляються.

Чи достатню кількість клітин рекрутують і мобілізують? Чи не є надто коротким період часу? Чи не перешкоджає мікросудинне ураження пенетрації клітин в інфарктну зону? Чи не є мікрооточення в ділянці інфаркту ворожим для приживлення введених клітин і їх життєздатності і чи не будуть пересаджені клітини негативно взаємодіяти з міокардіальними клітинами і запальними клітинами? Ще одна ділянка інтересу пов’язана зі зниженням кількості і функціональної здатності ендотеліальних клітин-попередників в асоціації з коморбідними станами, а також тим, чи не можна було б поліпшити функціональність цих «хворих» клітин перед трансплантацією. Експериментальні дослідження стратегій підсилення клітин дали змогу ідентифікувати кілька нових та інтригуючих підходів до поліпшення виживання, затримки в зоні інтересу, інтеграції і приживлення пересаджених клітин. Цими підходами є трансдукція клітин генами, що сприяють виживанню, й обробка клітин перед трансплантацією певними маленькими молекулами, що дає змогу активувати їх. Інші підходи сфокусовані на попередньому лікуванні цільових тканин, щоб підсилити активний рекрутмент клітин, їх виживання і затримку, оскільки приживлення стовбурових клітин у зоні інтересу і їх виживання дуже чутливі до локального клітинного оточення. Ці потенційні стратегії включають модифікацію цільової зони шоковими хвилями низької енергії і введення факторів росту (наприклад фактор, отриманий із стромальних клітин). Підсилення стовбурових клітин через їх генетичну модифікацію перед трансплантацією забезпечує альтернативний інноваційний підхід.

На вибір клітин, місця їх введення і методу доставки може впливати первинний діагноз і патологічний субстрат (наприклад гострий ІМ, ішемічна кардіоміопатія на противагу неішемічній чи первинне судинне захворювання), а також час введення клітин щодо початку інфаркту міокарда.

Кінцеві точки клінічних досліджень

На рисунку 6 проілюстровано ієрархічну класифікацію клінічних і механістичних кінцевих точок, яку можна використати при дизайні досліджень. Незаперечним доказом ефективності було би зменшення кількості смертей і частоти виникнення серцевої недостатності, й одне таке дослідження вже планується (1400 пацієнтів), воно матиме статистичну потужність, щоб оцінити вплив на ці кінцеві точки. І все ж таки сьогодні фокус більшості досліджень повинен бути механістичним, у них слід використовувати сурогатні кінцеві точки. Цими сурогатними кінцевими точками є виміри за допомогою різноманітних візуалізаційних методик глобальної і регіонарної функції лівого шлуночка, оцінка процесу ремоделювання і вимірювання розміру ІМ.

Безпека

Дотепер результати стосовно безпеки клітинної терапії були обнадійливі, але треба врахувати, що кількість пацієнтів в індивідуальних дослідженнях була малою, а також те, що затримка клітин і їх виживання в міокарді через 1 тиждень після введення є мінімальними. У тому випадку, коли зусилля щодо поліпшення затримки клітин у зоні інтересу, їх виживання, росту і посилення регенеративного потенціалу стануть успішними, одним із пріоритетів стане безпека лікування.

Аритмогенез. Тривають дебати щодо того, чи є стовбурові клітини проаритмогенними. Кілька ранніх досліджень задокументували злоякісні шлуночкові аритмії після трансплантації скелетних міобластів. Докази свідчать, що цей феномен може залежати від часу і після 2–4 тижнів частота аритмій знижується. Залишається незрозумілим, чи аритмії пов’язані з методами хірургічної реваскуляризації і доставки клітин, чи з вихідним ішемічним субстратом.

Ще треба встановити, чи будуть проаритмогенними інші типи клітин. Проведені дотепер дослідження не дали доказів проаритмогенного ефекту, мало того, у пацієнтів, що отримали клітинну терапію, раптова серцева смерть траплялася рідше. І все ж таки концептуально потенціал для підсилення аритмогенезу існує. Важливими факторами можуть бути ефективність міжклітинного з’єднання, електрична гетерогенність унаслідок неповної диференціації клітин та ін.

Онкогенна трансформація. Незважаючи на велику кількість експериментальних доказів онкогенної трансформації, особливо стосовно ембріональних та інших плюрипотентних стовбурових клітин, у клінічних дослідженнях не засвідчено зростання частоти пухлин.

Мультиорганне обсіменіння. Клітини, які вводяться інтракоронарно, можуть бути ідентифіковані в селезінці, легенях і печінці. Дотепер такі знахідки не були клінічно значущими, але можуть стати такими, якщо кількість клітин, які вижили, суттєво зросте.

Аберантна диференціація клітин. Плюрипотентність означає, що клітини мають потенціал диференціюватись у різноманітні типи клітин. На моделі гострого ІМ у мишей безпосередня інтраміокардіальна ін’єкція неселектованих клітин кісткового мозку викликала індукцію вираженої інтраміокардіальної кальцифікації, а після введення МСК — формування кістки. Ці дані свідчать про потенційний ризик терапії стовбуровими клітинами, який в людей ще треба дослідити.

Філософські та етичні проблеми

Чи стане терапія стовбуровими клітинами важливою частиною терапевтичного арсеналу при лікуванні серцево-судинних захворювань? Наразі сумнівно. Клінічні дослідження в людей виявили позитивну тенденцію, крім того, на деяких тваринних моделях виявлено екстраординарні позитивні ефекти. Але доречним є почуття стриманого оптимізму. Наприклад, корисний урок можна почерпнути з розвитку ангіогенезу і методів генної терапії. Перший пацієнт увійшов у клінічне дослідження в 1994 році, однак після приблизно 11 клінічних досліджень, які тривали 14 років, жоден серцево-судинний генний продукт не засвідчив клінічної ефективності.

Терпець громадськості й тих організацій, які спонсорують дослідження, обмежений, а дослідження дуже дорогі.

Загалом фундаментальні регуляторні й етичні вимоги до дослідження препаратів та інших клінічних досліджень також застосовуються і до методів клітинної терапії. Однак дослідження клітинної терапії породжує нові етичні проблеми, які включають дебати стосовно використання ембріонального матеріалу для досліджень.

Інші проблеми включають питання власності клітинних ліній, інтелектуальної власності, патентів тощо. Оскільки використання аутологічних стовбурових клітин пацієнтів не має прямого зв’язку з інтелектуальною власністю, фінансування дослідження стовбурових клітин біотехнологічними компаніями обмежується або технологіями ізоляції клітин, або пристроями для доставки клітин. Однак ця ситуація може змінитися, коли з’являться нові лінії стовбурових клітин, які не є аутологічними, а також унікальні методи обробки клітин. Тоді на порядок денний вийдуть проблеми власності, контролю ціни і доступності клітинних ліній. Сьогодні дорогі рандомізовані клінічні дослідження фінансуються переважно за рахунок неприватних організацій.

Висновок

Вихід клітинної терапії, спрямованої на репарацію серця, на клінічну арену досить інтригуючий. Ще треба встановити, чи майбутнє такого лікування полягатиме в регенерації міоцитів, чи у відновленні серця і його захисті через залучення клітинних, аутокринних і паракринних реакцій, які зменшують апоптоз і посилюють васкулогенез, інотропізм і метаболічне модулювання. Імовірно, ключем до майбутнього терапії стовбуровими клітинами є розуміння геномних і протеомних субстратів, які модифікують множинні сигнальні системи, залучені у трансформацію плюрипотентної клітини в міоцит. Докази трансдиференціації клітин у міоцити, отримані дотепер, викликають розчарування, однак це ще не означає, що ціль абсолютно нереалістична. Ця сфера медицини лише почала розвиватись, і використання різних типів клітин, керованого їх розвитку і ліпше розуміння механістичних концепцій ще може дати свої плоди. Трансдиференціація відбувається, однак з дуже низькою частотою, проте, імовірно, цей неефективний процес можна стимулювати методами, спрямованими на клітину і на субстрат. Перспективним є зведення в одне ціле генної і клітинної терапії, доказом чого є трансдукція генів у стовбурових клітинах з метою модифікувати їх затримку і виживання в зоні інтересу. Також вивчається перспектива використання стовбурових клітин як векторів для доставки препаратів і як моделей для розуміння базисної біології захворювання.

Підготував Володимир Павлюк